專利名稱：高溫地衣芽孢桿菌及其產高溫淀粉酶的制作方法
技術領域：
本發明屬應用微生物領域。具體地，涉及地衣芽孢桿菌(泡"7A/s
ij'c/ emYbr孤's) Tamy6菌株，以及從中獲得的高溫酸性淀粉酶。
背景技術：
高溫酶由于能更適合苛刻的工業生產過程，所以在工業和生物技術領域得到 廣泛的應用。
淀粉酶是目前應用最多的一種酶，它在淀粉工業中具有最廣泛的應用，能水 解和消化淀粉。淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 2)是一種外切型淀粉酶,它作用于淀粉時從非 還原性末端依次切開a-l， 4鍵，生成麥芽糖,與此同時將Cl的構型由ot-型轉變成P _ 型。淀粉酶不能水解支鏈淀粉的淀粉酶是目前應用最多的一種酶，它在淀粉工業 中具有最廣泛的應用，能水解和消化淀粉。淀粉酶(E.C.3.2..1.2)是一種外切型 淀粉酶，它作用于淀粉時從非還原性末端依次切開a-1， 4鍵，生成麥芽糖，與此同時 將Cl的構型由ot-型轉變成P-型。淀粉酶不能水解支鏈淀粉的a-1， 6鍵，也不獸鵬 過分支點a-l， 6鍵而切開內部的a-l， 4鍵，故水解支鏈淀粉是完全的。
目前淀粉加工過程不僅需要耐高溫的淀粉酶，而且需要將pH值調到5. 8~6. 5皿 行液化，然后再將它降為4. 2-4. 5進行糖化。這兩步pH值的調節增大了化學試劑的 消耗，同時也需要在最后的終產物處理中禾U用離子交換將多余的鹽分除去。如果能 夠有一種能在低pH值下作用的淀粉酶將降低這些消耗，簡化過程，減少副產物的產 生。因此篩選出能耐高溫，且最適催化pH在5左右的淀粉酶的菌株，其產生的淀粉 酶能較好地符合工業要求，對生產有一定的參考價值，值得做進一步的研究。
發明內容
本發明旨在提供一種能在高溫下產生具有較高酶活性的高溫酸性淀粉酶菌株。 本發明的另一目的在于提供一種從地衣芽孢桿菌(泡cj77"s h'c力emYb27 ^s) Tamy6菌株中獲得的高溫酸性淀粉酶。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案
地衣芽孢桿菌(泡ci"z/s h'c力e772'/027z &) Tamy6菌株，菌種保藏號為CGMCC No. 2642，其具有產生高溫淀粉酶的能力。
戶膽的地衣芽孢桿菌(泡ci"〃s/z'c/ e/n7bm/s) Tamy6菌株，其菌落為白色， 表面千燥，邊緣圓整；細孢為短桿狀，革蘭氏陽性菌；溫度范圍是38-70°C，驗 生長鵬為55°C。
本發明同時提供從地衣^fa桿菌(Sacj'"ws "c力朋j'/b27zu's) Tamy6菌株中獲
得的高溫酸性淀粉酶。
從地衣芽孢桿菌(萬aciWo Jj'c力eTLz'/ora7j、) Tamy6菌株中獲得的高溫酸性淀 粉酶的酶學性質為最適反應溫度為65。C，在8(TC下反應30min仍有85y。以上的酶 活，在98。C下，有40%的酶活，最適pH為4.5-5.5，在pH為9時也，高的活性。
從地衣芽孢桿菌("aciZ 〃s 7ic力e^'/onzz/s) Tamy6菌株中獲得的高溫酸性淀 粉酶，Native-PAGE結果顯示粗酶液中含有兩種成分的淀粉酶。
本發明突變體地衣芽孢桿菌(泡c277〃s "c力em'/b27zu's) Tamy6菌株已經于2008 年8月26日在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號 為CGMCC No. 2642。
戰方案中的地衣芽孢桿菌(勘c/Z "s力'c力e/n'/or孤's) Tamy6菌株，分離自
云南省騰沖熱海。菌株篩選固體培養基為(g/D: (NH4)2S04，1.3;蛋白胨，1;可
溶性淀粉，10; KH2P04， 0. 276; MgS04 7H20， 0. 25;酵母提取物，1;歸。04 2H20， 0.000025; CuS04， 0.000016; MnS04 H20， 0. 0022; ,， 0.0005; ZnS04 7H20， 0.0005; CoCl2'6H20， 0.000046; CaS04 H20， 0.06; FeS04， 0.099;瓊脂，20; pH7. 5。
i也衣芽孢桿菌(5aci"〃s ^c力e/w7b27zz/s) Tamy6菌株，菌落為白色，表面干 燥，邊緣圓整；細孢為短桿狀，革蘭氏陽性菌；驗范圍是38-7(TC，最適生長溫度為55°C。
經形態學和生理生化特征鑒定，結合16S rRNA基因序列分析，將分離的高溫 細菌鑒定為地衣芽孢桿菌種的一個菌株，命名為^3"7A/s h'c力e加Yb/7^'s sp. Tamy6。
地衣芽孢桿菌(泡ci7hs 7i'c力e/7iYb/7z i's) Tamy6菌株所產高溫酸性淀粉酶水 解可溶性淀粉的產物TLC結果分析如下
地衣芽孢桿菌(^scj77"s力'c力e7wYbiT^s) Tamy6菌株所產的高溫酶水解可溶 性淀粉的產物中不含有葡萄糖，水解的最終產物中含有麥芽糖，麥芽三糖和一些寡 糖，說明地衣芽孢桿菌(萬acj7Jos力'c/ e/7j7br加's) Tamy6菌株所產為高溫淀粉酶， 完全水解可溶性淀粉終產物有麥芽糖、麥芽三糖和一些寡糖。
地衣芽孢桿菌(萬aciW〃s 7i'c/ eyw'/br肌's) Tamy6菌株所產高纟顯酶Native-PAGE
分析結果如下
在Native-PAGE膠上能看到兩條帶，說明地衣芽孢桿菌6^w7^s iic力em'/br啦's) Tamy6菌株的發酵液中含有兩種組分的高溫淀粉酶。
地衣芽孢桿菌(萬aci'7^s h'c力em'/or肌's) Tamy6菌株所產高溫酸性淀粉酶最 適溫度為65。C，在80°。下仍有85%以上的酶活，在98"C下，大約還剩下40%左右的 酶活。最適pH為5左右，在pH為9時也有較高的活性。
圖1為Tamy6菌株產生的高溫酸性淀粉酶水解可溶性淀粉的產物TLC結果， 其中l: Marker (從上至下葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖)；2、菌株Tamy6粗酶液 消化的可溶性淀粉；4:未消化的可溶性淀粉；
圖2為Tamy6菌株產生的高溫酸性淀粉酶Native-PAGE結果，其中1: Tamy6 菌株所產粗酶液考馬斯R250染色結果；2: Tamy6菌株所產粗酶液淀粉活性染色結 果；圖3為Tamy6菌株產生的高溫酸性淀粉酶最適催化溫度曲線； 圖4為Tamy6菌株產生的高溫酸性淀粉酶最適催化pH曲線；
具體實施例方式
下面結合本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容 并不局限于此。 實施例h
地衣芽孢桿菌(^3Cj77〃s 〃c力e/w'/bi7M's) Tamy6菌株的分離篩選及鑒定。 地衣芽孢桿菌(^2Ci7Jos力'c力e;wYQr孤's) Tamy6菌株，分離自云南省騰沖熱 海。騰沖熱海的泥土在菌株篩選液體培養基中55i:,短時間搖瓶培養，涂布在菌株 篩選固體培養基上，55匸培養1 2天，挑出菌株點種于菌株篩選固體培養基上，55°C 培養3 4天后碘液著色，觀察透明圈大小，篩選出產淀粉酶的Tamy6菌株。菌株 篩選液體培養基為(g/U:(戰)2 S04， 1. 3;蛋白胨，1; KH2P04， 0. 276; MgS04 7H20， 0. 25;酵母提取物，1; Na2Mo04 2H20， 0. 000025; CuS04， 0. 000016; MnS04 H20， 0.0022; ,，0.0005; ZnS04 7H20， 0.0005; CoCl2 6H20， 0. 000046; CaS04 H20， 0.06; FeS04， 0.099; pH7.5。菌株篩選固體培養基為(g/L):(肌)2 S04， 1.3; 蛋白胨，1;可溶性淀粉，10; KH2P04， 0.276; MgS04'7H20， 0.25;酵母提取物， 1;歸o(V2恥，0.000025; CuS04， 0.000016; MnS04 H20， 0.0022; 貼03， 0. 0005; ZnS04 7H20， 0. 0005; CoCl2 6H20， 0. 000046; CaS04 肌0. 06; FeS04， 0.099;瓊脂，20; pH7.5。
采用細菌系統鑒定方法對地衣芽孢桿菌(5!3W'"ws Jic力e/ y/or肌's) Tamy6菌 株進行鑒定。該菌的形態學特征如下菌落為白色，表面千燥，邊緣圓整；細孢為 短桿狀，革蘭氏陽性菌；溫度范圍是38-70。C，最適生長溫度為55"C。
經形態學和生理生化特征鑒定，結合16S rRNA基因序列分析，經形態學和生理 生化特征鑒定，結合16S rRNA基因序列分析，將分離的高溫細菌鑒定為地衣芽孢桿菌種的一個菌株，命名為^acj'L^s 7j'c//e/w'/b/7zu\s sp. Tamy6。 實施例2:
將實施例1的地衣芽孢桿菌(Ssci〃ws "'c/ e/w'/oiTW's sp. ) Tamy6菌株接種 于50 ml菌株篩選液體培養基中，55-C搖床培養24h。按1: 10的比例接種至500 ml菌株篩選液體培養基中，55。C搖床培養4天。發酵液于4°C，6500卬m離心10 min， 收集發酵上清液，再用濾紙抽濾兩次。用10， 000 MWCO膜進行超濾濃縮至50 ml, 4°C 保藏濃縮液。
實施例3:
實施例2濃縮M可溶性淀粉的水解程度
(1) 將,G板115。C烘箱活化30min
(2) 點樣取硅膠薄板，在距底邊1.5cm7jC平線上間隔均勻的點樣，其中分別 點上Marker (含有葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖)、經過16 h水解1%可溶性淀粉 的樣品消化液，點樣點用吹風機吹干。
(3) 展層層析缸內倒入深度為lcm左右的展層劑(正丁醇、冰乙酸、水，5: 3: 2， V/V/V)，將薄層板放入層析缸進行展層，當展層劑前沿離薄板頂端l-2cm時， 將薄板取出，涼干，進行二次展層。二次展層后將薄板放入65"C烘箱30min。
(4) 顯色噴灑顯色劑(4g 二苯胺，4ml苯胺及20ml85y。磷酸溶于200ml丙酮)， 然后于85t:烘箱中烘烤lCK-20min。
結果如圖l所示，表明Tamy6菌株產生淀粉酶。 實施例4: 實施例2濃縮液的Native-PAGE: Native-PAGE垂直凝膠電泳按Woo Jin Lim法進行(Woo Jin Lim， 2003)。 在凝膠上進行兩份相同樣品(濃縮發酵 行0.22 ixm濾膜過濾除菌)的電 泳，電泳后將凝膠切成兩半， 一半用于淀粉酶的活性染色，另一半樣品用于考馬斯
7亮藍染色。
Native-PAGE:不連續電泳中，分離膠濃度為12% (分離膠中加入終濃度為 0. 1%的淀粉溶液)，濃縮膠濃度為5%。電泳條件加樣15ul后，電壓調為130V， 在4。C下進行，電泳時間為3h。
②電泳結束后，將一半凝膠浸泡在3096Tris-Tcl緩沖液中，55"C溫育6h，用碘 液染色。根據碘-淀粉顯色的性質，被淀粉酶水解后的周圍會有明顯的7jC解圈產生。
(D)疑膠染色、脫色將另一半凝膠進行染色、脫色。其步驟為
a. 凝膠置于塑料盒中，加入考馬斯亮藍染色液(浸沒凝膠)，在脫色搖床上染 色30min。
b. 倒去考馬斯亮藍染液，用去離子水漂洗凝膠，然后加入100ml考馬斯亮藍脫 色液，在脫色搖床上染色30min,倒去脫色液，重新加入新的脫色液，脫色過液。
c. 當凝膠上的蛋白條帶清晰，基本無底色時，停止脫色，倒去脫色液，用去離 子水漂洗凝膠。
實施例5:
實施例2濃縮液特性
實施例2濃縮液中淀粉酶活性的測定酶活力測定方法為DNS測還原糖的方法 進行淀粉酶活性測定(Rick W， 1974)。高纟顯淀粉酶的水解活力單位定義為在一 定溫度下，每分鐘水解可溶性淀粉產生1 "g葡萄糖所需的酶量。
蛋白質濃度的測定采用LOWRY法進行測定(LOWRY. 0H， 1951)。
① 實施例2濃縮液的最適酶活溫度
將酶液加到磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中，在底物濃度為1% 可溶性淀粉的條件下，測定Tamy6菌株所產淀粉酶在13-98'C范圍內不同溫度下的 酶活。結果如圖3所示，表明該高溫淀粉酶的最適酶活溫度為65t:。
② 實施例2 M液的最適酶活pH:用pH3. 0至pHlO. 0的不同的緩沖液稀釋酶液，分別加入相應pH的1 %的可溶 性淀粉，在結果如圖4所示，表明Tamy6菌株所產的高溫酸性淀粉酶在pH5. 0時酶
活最高。
權利要求
1、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Tamy6菌株，菌種保藏號為CGMCC No.2642，其具有產生高溫淀粉酶的能力。
2、豐又禾lj要求1戶萬述的地衣芽 包桿菌(Aaci7〗iAs 2j'c力e/7i/b27zw'50 Tamy6 菌株，其特征在于菌落為白色，表面干燥，邊緣圓整；細孢為短桿狀，革 蘭氏陽性菌；溫度范圍是38-70°C，最適生長溫度為55'C。
3、 從權利要求1地衣芽孢桿菌(Saci"〃s h'c力e/7J'/b27Z7ys) Tamy6菌 株中獲得的高溫酸性淀粉酶。
4、 權利要求3的從地衣芽孢桿菌(紐j77〃s h'c力e/7J'/。潔's) Tamy6 菌株中獲得的高溫酸性淀粉酶，其酶學性質為最適反應溫度為65'C，在 80。C下反應30min仍有85%以上的酶活，在98。C下，有40%的酶活，最適 pH為4. 5-5. 5，在pH為9時也有較高的活性。
5、 根據權利要求3所述的一種從地衣芽孢桿菌(fec^^AS h'c力e/7i/b27Z7&) Tamy6菌株中獲得的高溫酸性淀粉酶，Native-PAGE結果 顯示粗酶液中含有兩種成分的淀粉酶。
全文摘要
本發明公開了產生高溫淀粉酶的地衣芽孢桿菌，和利用此菌株得到高溫酸性淀粉酶。該菌株能在38-70℃下生長，最適生長溫度為55℃。對高溫酸性淀粉酶水解可溶性淀粉產物進行了TLC分析，完全水解可溶性淀粉終產物有麥芽糖、麥芽三糖和一些寡糖，表明粗酶液中含有淀粉酶。同時對其粗酶液進行了Native-PAGE分析和基本酶學性質分析，顯示粗酶液中含有兩種組分的淀粉酶，酶的最適左右溫度為65℃，80℃下反應30min仍有85％以上的酶活，最適作用pH為4.5-5.5。本發明得到的淀粉酶作用溫度高、作用pH低、在淀粉工業中的液化和糖化領域蘊藏一定的應用潛力。
文檔編號C12N1/20GK101633898SQ200910094650
公開日2010年1月27日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者井申榮, 季秀玲, 李秋鵬, 林連兵, 偉 洪, 熊學權, 陸月情, 波 陳, 魏云林 申請人:昆明理工大學