專利名稱：選擇結合性物質固定化纖維和含有該纖維束的纖維排列體以及選擇結合反應方法、用于 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及將與被測物質選擇性結合的物質(本說明書中稱為“選擇結合性物質”)固定的纖維和含有該纖維束的纖維排列體，以及選擇結合性物質、與其選擇性結合的對應選擇結合性物質的結合反應方法，用于其的裝置及基材。
背景技術：
從各種生物遺傳信息解析的研究開始，以人體基因為主，涉及多個基因及其堿基序列、基因序列編碼的蛋白質以及由這些蛋白質二維地制備的糖鏈的信息正在快速地明晰。對于序列明確的基因、蛋白質、糖鏈等高分子的功能，可以用各種方法進行研究。主要對于核酸，利用Northern雜交或者Southern雜交等各種核酸/核酸間的互補性，可以研究各種基因與其生物功能表達的關系。對于蛋白質，可以利用免疫雜交代表的蛋白質/蛋白質間的反應研究蛋白質的功能和表達。
近年來，作為一次解析多個基因表達的方法，開發了被稱為DNA微陣列法(DNA芯片法)的新型分析法以及方法論，引人注目。這些方法均是以核酸/核酸間雜交反應為基礎的核酸檢測、定量方法，在這方面原理上與以往的方法相同，也可用于以蛋白質/蛋白質間或糖鏈/糖鏈間或者糖鏈/蛋白質間的結合反應為基礎的蛋白質或糖鏈的檢測、定量。這些技術的最大特征在于，使用在稱為微陣列或芯片的平面基板片上高密度地排列固定多個DNA片斷、蛋白質或糖鏈而得到的物質。作為微陣列法的具體使用方法，例如，用熒光色素等標記研究對象細胞的表達基因等，使得到的試樣在平面基板片上雜交，使互補的核酸(DNA或RNA)之間結合，用熒光色素等標記該部位后，用高分辨度解析裝置高速讀取的方法，或者檢測以電化學反應為基礎的電流值等的應答的方法。這樣，可以迅速推測出試樣中所含的基因種類。
作為用于將核酸固定在基板上的技術，除了與上述Northern印跡法相同，在尼龍片材等上高密度地進行固定的方法以外，為了進一步提高密度，開發出了在玻璃等基板上包覆聚-L-賴氨酸、氨基硅烷(アミノシラン)等進行固定的方法等。
但是，已經指出在對玻璃等固體表面進行化學或物理修飾得到的基板上點樣固定核酸的方法，點密度和每點可以固定的核酸量少，再現困難。而且，由于昂貴的制造裝置和多步的制造步驟，因而每個芯片大幅降低成本是很困難的。另外，核酸的區別不得不依賴于其在基板上點樣的位置，在基板上的配置和區別方面存在缺乏簡便性的問題。
關于使用蛋白質或糖鏈的微陣列，也存在這些與使用核酸的微陣列相同的問題。
作為不使用平面基板的方法，已知利用微小珠粒的方法，在區別固定了各種核酸、蛋白質或糖鏈的多種微小珠粒的技術方面，還不完全，難以制作使指定化合物以指定的排列標準、再現性良好地排列而成的物質。
另一方面，也嘗試在中空纖維中固定核酸(歐洲公開專利1162262)。該技術通過在一根中空纖維中固定某種核酸，形成1個核酸1個纖維的對應關系，從而進行各種核酸的區別。但是，該技術最終束縛中空纖維，根據其位置關系識別各核酸，在這點上，不能克服在基板上點樣核酸的技術中存在的問題。
另外，核酸/核酸間雜交中使用的核酸溶液昂貴，因而希望盡可能地減少核酸的量進行雜交反應，因此，考慮降低核酸溶液的核酸濃度，在與低濃度的核酸溶液進行雜交時，作為用于提高效率的方法，進行了下述嘗試，即在上述微陣列的基板上設置具有導電體層的標本核酸固定部位，在該標本核酸固定部位外加正電位，形成電場，將上述核酸溶液中的檢體核酸集中在上述標本核酸固定部位附近，局部提高標本核酸固定部位附近的核酸濃度，從而提高雜交效率(特開平8-154656號公報)。
對于使用蛋白質或糖鏈的微陣列，也期待與這些使用核酸的微陣列相同的效果。
但是，采用這些公知方法不能達到提高測定靈敏度和縮短雜交時間的效果，因此需要一種更有效的雜交方法。
發明公開在這種狀況下，在認為將來更加重要的高分子體解析中，強烈要求確立一種新型體系的方法論，能夠以給定的濃度固定高分子體，能夠以可測定的形式，高密度、再現性良好地進行排列，而且可以不依賴于位置排列識別各高分子體，能夠適用于廉價的大量制造，這也是本發明所要解決的課題。
具體地說，本發明所要解決的課題在于，提供一種方法，該方法與在尼龍片材或玻璃基板等二維載體上微量點樣或微量分注的高分子體排列體制造法相比，可以不依賴于位置關系區別識別各試樣，可以組合任意的排列體，另外可以根據使用方法自由變化密度，且能夠簡便地檢測出簡單結合的試樣與其他試樣的反應。
而且，在認為將來更加重要的高分子體解析中，強烈要求確立一種選擇結合反應的方法，可以有效利用少量貴重的核酸、蛋白、糖鏈、抗體、抗原等高分子體試樣，這也是本發明所要解決的課題。
具體地說，在以往使用的平面基板片上，在高密度地排列固定了多個DNA片斷、蛋白質或糖鏈等選擇結合性物質的微陣列中；或者將多孔性中空纖維內部固定了上述選擇結合性物質的該多孔性中空纖維集束固定，沿與排列體的纖維軸交叉的方向切成薄片，作為將上述選擇結合性物質體固定在纖維內部的二維高密度纖維排列體的微陣列中；或者在纖維表面高密度地排列固定上述選擇結合性物質，將該纖維作為三維結構體排列而成的維陣列等中，雜交反應依賴于選擇結合性物質的自然擴散，使用含有少量選擇結合性物質的溶液，高效率地引起雜交反應，有效利用貴重的選擇結合性物質比較困難，即使是為解決這種效率低下而發明的通過電吸引使選擇結合性物質的雜交反應效率化的方法中，效率化也不充分。
因此，本發明的目的在于消除上述說明的以前的缺點，提供一種有效利用少量選擇結合性物質進行選擇結合反應的結合反應方法以及用于該方法的裝置和基材。
本發明人為了解決如上所述的課題，進行了悉心研究，結果發現改變在同一個二維載體上進行選擇結合性物質排列步驟和固定步驟的以往方法的想法，可以制作這樣一種纖維束，即在作為一維結構體的能夠通過支撐體、磁、條形碼、顏色、形狀等進行區別的纖維上(1根纖維上)獨立地進行高分子體的固定步驟，能夠區別結合了各試樣的纖維，而不依賴于作為三維結構體的位置。
而且，還發現通過將光透過性基材或電傳導性基材用于該纖維，可以制作一種纖維或該纖維排列體，其能夠檢測出直接與該纖維固定的選擇結合性物質反應的物質，從而完成了本發明。
也就是說，本發明提供一種纖維排列體，其含有固定了選擇結合性物質的纖維或該纖維的束。
而且，本發明人為了解決如上所述的課題，進行了悉心研究，結果發現在雜交反應期間，通過使對應選擇結合性物質在微陣列基板或者纖維上固定的上述選擇結合性物質附近移動，提高上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質的碰撞概率，可以提高雜交反應的效率，從而完成了本發明。
也就是說，本發明提供一種選擇結合性物質與對應選擇結合性物質的結合反應方法，在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液同上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質發生結合反應的步驟中，相對于固定上述選擇結合性物質的面，使上述被測試樣液和/或上述對應選擇結合性物質相對移動。另外，本發明還提供一種選擇結合反應裝置，是在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液同上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質發生結合反應的裝置，具有設置上述基材的基臺；在與固定了上述選擇結合性物質的面的垂直軸交叉的方向上，且在上述選擇結合性物質固定區域兩端的外側設置的導電電極；在該導電電極間外加交流電壓的交流電壓外加裝置。而且，本發明還提供一種選擇結合性物質固定化基材，是在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液同上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質發生結合反應的上述基材，具有固定基材上的選擇結合性物質的選擇結合性物質固定用部位，以及在選擇結合性物質固定用區域兩端的外側設置的導電電極。
根據本發明，提供固定了選擇結合性物質的纖維以及固定了選擇結合性物質的纖維排列體。根據本發明，可以提供有效、且再現性良好地固定了選擇結合性物質的纖維，同時通過組合這些纖維形成纖維排列體，可以再現性良好、有效地得到選擇結合性物質任意高密度且正確地排列的選擇結合性物質固定化纖維排列體。而且，通過使用光纖，可以簡便地檢測出通過纖維效率良好地結合的試樣。另外，通過標記各纖維，可以不依賴于排列體中的位置鑒定結合了被測物質的各纖維。
另外，通過本發明的選擇結合反應方法、用于其中的裝置和基材，提高了選擇結合反應的效率，即使是被測試樣中的對應選擇結合性物質濃度低的場合，也可以在短時間內完成選擇結合反應步驟。
圖1是本發明的選擇結合反應裝置的斷面示意圖和平面示意圖。
圖2是表示本發明的選擇結合反應方法中選擇結合性物質的行為的原理圖。
圖3是以往的雜交裝置的斷面示意圖。
圖4是表示以往的雜交裝置中選擇結合性物質的行為的原理圖。
圖5是實施例5中使用的測定裝置的光學系統部分的示意圖。
發明的最佳實施方式在本說明書和權利要求書中，“選擇結合性物質”是指能夠與被測物質直接或間接選擇性結合的物質，作為代表性的實例，可以例舉核酸、蛋白質、糖類和其他抗原性化合物。核酸可以是DNA，也可以是RNA。具有特定堿基序列的單鏈核酸選擇性地與具有和該堿基序列或其一部分互補的堿基序列的單鏈核酸雜交、結合，因此屬于本發明所說的“選擇結合性物質”。另外，作為蛋白質，可以例舉抗體和Fab片斷或F(ab’)2片斷等抗體的抗原結合性片斷，以及各種抗原。抗體或其抗原結合性片斷與對應的抗原選擇性結合，抗原與對應的抗體選擇性結合，因此屬于“選擇結合性物質”。作為糖類，優選多糖類，可以例舉各種抗原。另外，也可以固定蛋白質和糖類以外的具有抗原性的物質。作為“選擇結合性物質”，特別優選的物質是核酸、抗體和抗原。本發明中使用的選擇結合性物質可以是市售的物質，也可以是由活細胞等得到的物質。另外，“對應選擇結合性物質”是指與上述選擇結合性物質選擇性結合的物質，例如，在選擇結合性物質是單鏈核酸的場合，是具有與該單鏈核酸互補的堿基序列的單鏈核酸，在選擇結合性物質是抗體或其抗原結合性片斷的場合，是與其進行抗原抗體反應的抗原或半抗原。
本發明中，作為能夠用于固定選擇結合性物質的纖維，可以例舉合成纖維、半合成纖維、再生纖維、無機纖維等化學纖維、天然纖維以及這些纖維的復合纖維等。
作為合成纖維的代表性實例，例如尼龍6、尼龍66、芳香族聚酰胺等聚酰胺類各種纖維，聚對苯二甲酸乙二酯、聚對苯二甲酸丁二酯、聚乳酸、聚乙醇酸等聚酯類各種纖維，聚丙烯腈等丙烯酸類各種纖維，聚乙烯或聚丙烯等聚烯烴類各種纖維，聚乙烯醇類各種纖維，聚偏二氯乙烯類各種纖維，聚氯乙烯類纖維，聚氨酯類各種纖維，酚類纖維，聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯等構成的氟類纖維，聚亞烷基對氧基苯甲酸酯類各種纖維等。另外，也可以使用衣料用纖維以外的纖維，例如以聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯等透明非晶性高分子為主材料的光學纖維等。特別優選芯由聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料構成，包層是由折射率比其低的材料構成的塑料光纖。可以是所謂芯皮型光纖，也可以是折射率分布型光纖。而且，也可以對塑料光纖進行包覆。作為包覆材料，沒有特別的限定，可以使用聚乙烯、PVC、尿烷、氟樹脂等熱塑性樹脂或各種橡膠管等。
作為半合成纖維的代表性實例，例如以二乙酸酯、三乙酸酯、殼多糖、殼聚糖等為原料的纖維素系衍生物類各種纖維、被稱為普羅米克斯的蛋白質類各種纖維等。作為再生纖維的代表性實例，可以例舉通過粘膠人造絲工藝、銅-氨法或有機溶劑法得到的纖維素類各種再生纖維(人造絲、銅氨纖維、波里諾西克等)等。
作為無機纖維的代表性實例，例如玻璃纖維、碳纖維、Au、Ag、Cu、Al等金屬纖維等。特別優選光透過性的玻璃制光纖。與塑料制光纖的場合相同，可以是所謂的芯皮型光纖，也可以是折射率分布型光纖。另外，也可以對玻璃制光纖進行包覆。而且，也可以是玻璃和塑料的復合類光纖。
作為天然纖維的代表性實例，例如棉、亞麻、麻、黃麻等植物纖維，羊毛、絹等動物纖維，石棉等礦物纖維等。本發明中使用的纖維并沒有特別規定其形態。另外，可以是單絲，也可以是復絲。而且，也可以是將短纖維紡織得到的紡絲。另外，使用復絲或紡絲的纖維的場合，也可以在固定選擇結合性物質時，利用單纖維間的空隙等。
本發明中使用的纖維可以以未處理的狀態直接使用，但根據需要，也可以是引入了反應性官能團的纖維，另外，也可以是進行了等離子體處理、γ射線、電子束等放射線處理的纖維。在這些纖維上固定選擇結合性物質的場合，可以利用纖維和選擇結合性物質之間的各種化學或物理性相互作用，即纖維具有的官能團和選擇結合性物質之間的化學或物理性相互作用，通過公知方法實現。
固定相同的選擇結合性物質的場合，可以一次集中處理若干根纖維。固定位置可以是纖維整體，但為了減少檢體試樣的量，優選是纖維的端部區域。端部區域可以是纖維的端面和/或端面附近的側面。為了區別固定了不同選擇結合性物質的纖維，可以通過在支撐體上固定纖維區別固定了不同試樣的纖維。該支撐體可以各個獨立，也可以各個結合。或者，也可以使用改變了形狀的纖維。
也可以使纖維帶有顏色，根據該顏色的波長區別不同試樣的纖維。也可以采用通過檢測向纖維外釋放的光，或者使光在纖維中通過并將通過纖維的光導向光檢測器進行區別的方法。
也可以使用記錄了特殊文字記號的纖維進行區別。例如，在纖維上或纖維中記錄條形碼等，通過讀取該條形碼區別試樣不同的纖維。
也可以使纖維含有金屬、碳、導電性聚合物等導電性材料或磁性材料，或者使用濺射、蒸鍍法、電鍍、CVD等方法在纖維表面涂覆金屬等材料，使之具有導電性。可以使用上述方法，在纖維的表面涂覆元素周期表3A族至5B族的第2周期至第4周期所含的材料或其混合物。這樣，可以利用電或磁區別試樣不同的纖維。
本發明中使用的纖維優選細的纖維。本發明優選的實施方式中，一根纖維的粗度最好為1mm以下。對于單絲，例如市售魚線的場合，為50～900μm粗的絲。而且，根據最近的紡絲技術，可以制造1dtex(聚對苯二甲酸乙二酯的場合，直徑約為8μm)的單絲，也可以制造更細的纖維(極細纖維或超極細纖維)(直徑1～10μm)。使用光纖的場合，也優選光纖為3～1000μm。更希望為50～1000μm，特別是從操作性等觀點出發，希望為50～500μm的塑料制光纖、玻璃制光纖、玻璃和樹脂的復合光纖。另外，也優選使用將2～50μm那樣細的光纖集成束得到的所謂導象管。在一個一個這樣的導象管上固定不同的選擇結合性物質，再將導象管匯集，從而可以進行測定。而且，用光檢測結合狀態的場合，通過使用該導象管，可以使聚束的光在光纖內部不發散，有效地將檢測光送到試樣處。導象管所含的光纖數優選為2～50000根。如果多于50000根，則導象管的外徑過粗，有時在操作上產生困難。
上述纖維中，使用光纖時，作為在后面詳細說明的被測物質上附加的標記，通過使用熒光標記等發光或生成色素的標記，通過穿過光纖在另一端側發出的光可以測定被測物質的結合，此時，由于可以檢測出哪一個纖維發光，因此優選，對于裝置的自動化，也是有利的。另外，使用導電性纖維的場合，作為電信號可以在纖維的另一端側測定被測物質的結合，此時，也可以檢測出被測物質與哪一個纖維結合，因此優選，對于裝置的自動化也是有利的。而且，如果使用導電性纖維，通過外加電場、電流等方法，也可以促進結合。特別是，在促進核酸的雜交時，優選實質上使固定核酸的纖維為陽極。另外，對于陰極的設置，只要不與纖維直接接觸即可，沒有特別的限定。外加的電場的種類特別優選直流，但作為實質上纖維為陽極的條件，也可以為交流。也就是說，即使外加交流電場的場合，可以是對纖維外加正電壓和負電壓的時間使正電壓的變大，或者交流的正電壓和負電壓的絕對值使正電壓的變大，或者通過它們的組合使纖維實質上成為陽極。外加電壓的大小沒有特別的限定，優選0.1V以上5000V以下。外加電壓如果小于0.1V，則有時不能充分得到外加電壓的效果，如果大于5000V，則操作變得困難。外加電壓時，對于是否流過電流，沒有特別的限定。如果設置陰極使之不與反應溶液接觸，則不流過電流，但如果設置陰極使之與反應溶液接觸，則電流通過溶液流過。流過電流時，其大小優選1～2000mA。
另一方面，如上所述，本發明還提供一種選擇結合性物質與對應選擇結合性物質的結合反應方法，在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液同上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質發生結合反應的步驟中，相對于固定了上述選擇結合性物質的面，使上述被測試樣液和/或上述對應選擇結合性物質相對移動。其中，“相對移動”是指從橫向觀察固定了上述選擇結合性物質的面時，對應選擇結合性物質相對于該固定面相對移動。
另外，在該結合反應方法中，也優選使用上述選擇結合性物質固定化纖維或纖維排列體，但不是必須的，也可以適用于以往的使用微陣列或微板等的方法。
作為使對應選擇性結合物質在微陣列基板或纖維等上固定的選擇結合性物質附近移動，提高選擇結合性物質與對應選擇結合物質的碰撞概率的方法，可以考慮下述方法，形成電場，使帶電荷的選擇結合性物質移動的方法；形成用于使被測試樣液在選擇結合性物質固定化基材上流動的流路，使用微泵使被測試樣液移動的方法；使被測試樣液具有磁性流體那樣的功能，通過來自外部的物理力使被測試樣液搖動的方法；或者使選擇結合性物質固定化基材搖動的方法等。
其中，優選結構最簡單且具有提高碰撞概率效果的外加電場法，特別優選外加交流電場法。一般地，核酸在水溶液中帶負電。另外，蛋白質和多糖類等高分子在水溶液中多數情況下也帶電。因此，通過對反應液外加電場，可以使對應選擇結合性物質移動。特別是，通過外加交流電場，可以使對應選擇結合性物質往復運動，可以有效地提高與選擇結合性物質的碰撞概率。
因此，作為上述本發明的結合反應方法的優選方式，本發明還提供一種選擇結合性物質與對應選擇結合性物質的結合反應方法，在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液同上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質發生結合反應的步驟中，在與固定了選擇結合性物質的面的垂直軸交叉的方向上，且在上述選擇結合性物質固定化區域兩端的外側設置的導電電極之間外加交流電壓，同時進行上述結合反應。
其中，固定了選擇結合性物質的面的垂直軸例如是在后述圖1(a)中用虛線A表示的軸，是指相對于固定了選擇結合性物質的面垂直的方向。另外，與該垂直軸交叉的方向例如如后述圖2用左右箭頭表示的方向所示，是從側面觀察固定了選擇結合性物質的面時，與上述垂直軸交叉的方向。另外，該“與垂直軸交叉的方向”如圖2所示，優選與垂直軸正交的方向，但不是必須正交，從側面觀察選擇結合性物質固定化面時，以最短距離連接對峙的電極間的線和與垂直軸正交的方向所成的角度優選為45度以下，更優選為30度以下的場合，也可以得到優良的效果。
外加電壓的大小沒有特別的限定，但如果過小，外加電場得到的效果變小，另一方面，如果過大，則恐怕損傷選擇結合性物質和/或對應選擇結合性物質，因此，導電電極間隔每1cm，優選為約5V至50V，特別優選約10V至25V。另外，交流的頻率沒有特別的限定，優選約1Hz至100Hz，特別優選約5Hz至20Hz。
上述選擇結合性物質固定化部位可以只有1個(例如微板的1個孔等)，選擇結合性物質固定化部位存在多個，存在將其排列而成的選擇結合性物質排列區域(例如后述圖1(a)中參考編號8所示的區域)時，可以同時并列進行多種測定，因此優選，此時，上述導電電極優選設置在該選擇結合性物質排列區域兩端的外側。
上述本發明的通過外加電場法進行的結合反應方法可以使用下述裝置進行，即具有設置上述基材的基臺；在與固定了上述選擇結合性物質的面的垂直軸交叉的方向上，且在上述選擇結合性物質固定化區域兩端的外側設置的導電電極；在該導電電極間外加交流電壓的交流電壓外加手段的選擇結合反應裝置，或者具有固定基材上選擇結合性物質的選擇結合性物質固定用部位以及在選擇結合性物質固定用區域兩端的外側設置的導電電極的選擇結合性物質固定化基材。另外，在“選擇結合性物質固定用部位”固定選擇結合性物質，該固定也可以在使用前由終端用戶進行，或者基材的制造者也可以制造、銷售預先固定了用于特定試驗的選擇結合性物質的產品。
另外，在本發明的選擇結合反應方法和選擇結合反應裝置中，作為能夠用于上述導電電極的材料，可以例舉鉑、金、銀、鉻、鈦、鎳、鋁、銅、鈀等金屬單質，或者這些金屬的氧化物、氮化物或它們的合金、碳或碳化合物、或者導電性聚合物等，可以含有選自其中的至少一種。
作為金屬單質或這些金屬的氧化物、氮化物或它們的合金的特性，由于在使用這些材料設置的導電電極之間外加交流電壓，從而通過含有上述對應選擇結合性物質的被測試樣液，在上述導電電極間流過電流，因此希望是與被測試樣液反應，難以在被測試樣液中溶出金屬離子的材料。
作為碳化合物的代表性實例，例如石墨、フラ-レン等。
作為導電性聚合物的代表例，例如聚乙炔、聚吡咯、ポリチオフィン、聚苯胺等，也可以例舉將這些導電性聚合物與上述金屬、碳化合物等混和，改善了導電特性的復合導電性塑料等。
由于后述的理由，希望預先在選擇結合性物質固定化基材上形成導電電極，但也可以是在結合反應裝置側具有導電電極，在結合反應準備階段在選擇結合性物質固定化基材上安裝導電電極的形態。
作為使用這些材料在基材上設置電極的手段，使用金屬作為電極材料的場合，可以在基材上設置具有導電電極形狀的開口的掩膜，通過濺射法、蒸鍍法形成導電電極，或者使用電鍍法形成厚膜的導電電極，再用粘結劑在基材上粘結金屬箔或金屬薄板形成導電電極。使用碳化合物的場合，可以在基材上設置具有導電電極形狀的開口的掩膜，使用濺射法形成電極。使用導電性聚合物的場合，可以使用絲網印刷等印刷法，涂覆糊狀導電性聚合物，通過利用紫外線進行光固化的方法，使糊固化，形成導電電極。
另外，在選擇結合反應裝置側具有導電電極的場合，在選擇結合反應裝置的基臺上部具有使用上述金屬材料、碳化合物、導電性聚合物制造的薄板狀電極板，在基臺狀擔載選擇結合性物質固定化基材后，在選擇結合性物質固定化基材上安裝該電極板，從而可以形成導電電極。
下面使用
本發明的一個實施方式。本發明的選擇結合反應裝置的一個實施方式的側視圖如圖1(a)所示，平面圖如圖1(b)所示。另外，本發明并不只限于這一實例。在圖1、圖2中，具有選擇結合性物質排列基材1，導電電極2、3，蓋板5和交流電壓外加手段6。在設置于選擇結合性物質排列基材1上的選擇結合性物質固定用部位4上固定選擇結合性物質10，形成選擇結合性物質10陣列狀排列的選擇結合性物質排列區域8。在載置于基臺9上的選擇結合性物質排列基材1上，在選擇結合性物質排列區域8的兩側設置導電電極2、3，在該導電電極2、3上架設蓋板5。通過上述導電電極2、3，在選擇結合性物質排列基材1和蓋板5夾持的空間填滿含有上述對應選擇結合性物質11的被測試樣溶液7。
在上述選擇結合性物質排列區域8上選擇結合性物質10排列的形態，希望排列在二維平面的格點上，但偏離二維平面格點的位置、直線狀、或者選擇結合性物質固定用部位4的位置在與選擇結合性物質排列基材1表面垂直的方向上分別具有位差，從而也可以是三維的排列形態。
充滿被測試樣溶液7后，使用交流電壓外加手段6，在導電電極2、3之間外加電壓。由此，在導電電極2、3之間產生電場，在被測試樣溶液7中自然擴散的對應選擇結合性物質11具有負電荷，因而根據導電電極2、3之間產生的電場的方向，在橫切上述選擇結合性物質排列區域8的方向上反復移動。具體地說，導電電極2為正電位、導電電極3為負電位的場合，上述對應選擇結合性物質11靠近導電電極2，導電電極2為負電位、導電電極3為正電位的場合，上述對應選擇結合性物質11靠近導電電極3。這樣，在對應選擇結合性物質11橫切上述選擇結合性物質排列區域8進行移動的過程中，選擇結合性物質固定用部位4上固定的選擇結合性物質10與對應選擇結合性物質11接觸，相互具有互補序列的場合，發生雜交。
另外，外加在導電電極上的電壓越高，具有負電荷的選擇結合性物質7和對應選擇結合性物質11由導電電極受到的電吸引力或電排斥力增強，對應選擇結合性物質11移動引起的與選擇結合性物質7的接觸的效果升高，這是不言而喻的，但如果長時間外加高電壓，則選擇結合性物質7和對應選擇結合性物質11受到損傷，因此在本實施方式中，導電電極間隔每1cm，設定為5V至50V之間，為了得到穩定的雜交結果，更優選導電電極間隔每1cm，為10V至25V。
如上所述，在本發明的通過交流電場實現選擇結合反應的效率化的方法中，選擇結合性物質10與對應選擇結合性物質11發生結合反應的期間，經常相對移動，反復進行碰撞、接觸，因而結合反應的效率提高。
其中，作為選擇結合性物質固定用部位，通常使用基板上設置的平面上的位置或者基板上的一部分區域、基板上設置的凹部或凸部，也可以在貫穿選擇結合性物質排列基材1的孔中插入棒狀的樹脂、玻璃、金屬、纖維等，使用該樹脂、玻璃、金屬、纖維的前端作為選擇結合性物質固定用部位。特別是，如果使用上述本發明的纖維或纖維束的端面作為選擇結合性物質固定用部位，如上所述，可以得到能夠在纖維的另一端部側進行檢測等優點，因而優選。
另外，為了減少貴重的被測試樣溶液7的量，希望上述導電電極2、3盡可能地薄，更希望為5μm至200μm。為了形成這樣非常薄且很少出現厚度不均的電極，希望預先在選擇結合性物質排列基材上形成上述導電電極，也可以是在結合反應裝置側具有導電電極，在結合反應準備階段，在選擇結合性物質排列基材1上安裝導電電極的方式。
另外，在以往的方法中，雜交反應依賴于選擇結合性物質的自然擴散，因而上述選擇結合性物質10與對應選擇結合性物質11的接觸概率低，因此雜交反應的效率低。而且，為了消除該無效率性，如圖3、圖4所示，即使在針對利用電吸引使選擇結合性物質的雜交反應效率化的方法中，效率化也不充分。
對于以往利用電吸引使雜交效率化的方法，使用圖3、圖4進行說明。在設置于選擇結合性物質排列基材12上的選擇結合性物質固定用部位15上，固定選擇結合性物質10。在選擇結合性物質排列基材12上排列了選擇結合性物質10的區域的外側，設置支撐材料13，在支撐材料13上架設蓋板14。通過上述支撐材料13，在選擇結合性物質排列基材12和蓋板14夾持的空間充滿含有對應選擇結合性物質11的被測試樣溶液18。充滿被測試樣溶液18后，使用電壓外加手段17，在電極16上外加負電位，在具有有導電性的層的選擇結合性物質固定部位15上外加正電位，從而在電極16和選擇結合性物質固定部位15之間產生電場，在被測試樣溶液18中自然擴散的對應選擇結合性物質11具有負電荷，因而被吸引至上述選擇結合性物質固定部位15。由此，選擇結合性物質固定部位15周圍的對應選擇結合性物質11的濃度增高，或者對應選擇結合性物質1吸附在選擇結合性物質固定部位15上的過程中，選擇結合性物質10與對應選擇結合性物質11接觸，發生雜交。
但是，在圖3所示的方法中，對應選擇結合性物質11通過電力被吸附在選擇結合性物質固定部位15上，而且，與對應選擇結合性物質11同樣具有負電荷的選擇結合性物質10也被吸附在選擇結合性物質固定部位15的表面，在選擇結合性物質10和對應選擇結合性物質11之間，相對的移動減少，因此，與本發明相比，選擇結合性物質10與對應選擇結合性物質11的動態接觸概率低。
本發明中，作為用作選擇結合性物質或對應選擇結合性物質的DNA或RNA，可以是由活細胞制備的，也可以是化學合成的。由活細胞制備DNA或RNA可以通過公知的方法，例如對于DNA的提取，可以通過Blin等的方法(Blin等人，Nucleic Acids Res.32303(1976))等，另外，對于RNA的提取，通過Favaloro等的方法(Favaloro等人，Methods Enzymol.65718(1980))等進行。作為固定的核酸，還可以使用鏈狀或環狀的質粒DNA或染色體DNA、用限制酶或化學地將它們切斷得到的DNA片斷、在試管內用酶等合成的DNA、或者化學合成的低聚核苷酸等。
在1根纖維或各選擇結合性物質固定用部位上，通常固定1種選擇結合性物質，但例如欲使具有變異的多種基因結合在同一固定用部位區域的場合等，也可以在1根纖維或1個固定用部位上固定多種選擇結合性物質。
另外，在多個纖維或多個選擇結合性物質固定用部位上固定的選擇結合性物質，可以是分別不同種類的選擇結合性物質，也可以是相同的選擇結合性物質。另外，在多個纖維或多個選擇結合性物質固定用部位中，可以在一部分纖維或選擇結合性物質固定用部位上固定1種選擇結合性物質，在另外部分的多個纖維或選擇結合性物質固定用部位上固定另外一種選擇結合性物質。選擇結合性物質的種類、順序不受纖維排列體中纖維位置的限定。在多個纖維或選擇結合性物質固定用部位上固定相同的選擇結合性物質，對進一步提高測定靈敏度也是有效的。
選擇結合性物質在支撐體纖維上或者在選擇結合性物質固定用部位上的固定，可以通過公知方法進行。在纖維或選擇結合性物質固定用部位上固定未修飾的選擇結合性物質的場合，可以使選擇結合性物質與纖維或選擇結合性物質固定用部位發生作用后，通過烘焙或照射紫外線進行固定。在后述的實施例中，采用該方法，將DNA固定在聚甲基丙烯酸甲酯光纖纖維或聚甲基丙烯酸甲酯基材上。另外，將用氨基修飾的選擇結合性物質固定在纖維上的場合，可以使用戊二醛或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)等交聯劑，使之與纖維的官能團結合。使含有選擇結合性物質的試樣與纖維發生作用時的溫度優選5℃～95℃，更優選15℃～65℃。處理時間通常為5分鐘～24小時，優選1小時以上。
本發明中，可以將選擇結合性物質直接固定在纖維或選擇結合性物質固定用部位上，另外，也可以固定對選擇結合性物質進行了化學修飾得到的衍生物或根據需要使之改性的核酸。核酸的化學修飾，已知氨基化、生物素化、地高辛配基化等[Current Protocols InMolecular Biology，Ed，；Frederick M.Ausubel等人(1990)、脫同位素試驗方案(1)DIG雜交(秀潤社)]，本發明中，可以采用這些修飾法。作為一個實例，對在核酸中引入氨基進行說明。具有氨基的脂肪族烴鏈與單鏈核酸的結合位置沒有特別的限定，不僅可以是核酸的5’末端或3’末端，也可以是核酸鏈的中間部位(例如磷酸二酯結合部位或堿基部位)。該單鏈核酸衍生物可以按照特公平3-74239號公報、美國專利4667025號、美國專利4789737號等記載的方法進行制備。除該方法以外，例如可以使用市售的氨基引入用試劑[如アミノリンクII(商品名)，PEバイオシステムズジヤパン社；AminoModifiers(商品名)，クロンテツク社]等，或者按照在DNA 5’末端的磷酸上引入具有氨基的脂肪族烴鏈的公知方法(Nucleic Acids Res.，11(18)，6513-(1983))進行制備。
采用上述方法得到的選擇結合性物質固定化纖維或選擇結合性物質固定化基材固定了選擇結合性物質后，可以進行適當的處理。例如，通過進行熱處理、堿處理、表面活性劑處理等，也可以使固定的選擇結合性物質改性。或者，使用由細胞、菌體等生物體材料得到的選擇結合性物質時，也可以除去不需要的細胞成分等。而且，可以使用處理后的纖維或選擇結合性物質固定化基材作為選擇結合性物質的檢測材料。另外，這些處理可以分別進行，也可以同時進行。另外，也可以在將含有選擇結合性物質的試樣固定在纖維或選擇結合性物質固定化基材上之前適當進行。
固定了選擇結合性物質的本發明的纖維或固定了選擇結合性物質的本發明的選擇結合性物質固定化基材，通過將固定的選擇結合性物質作為探針，使之與被測物質相互作用，從而可以檢測出檢體中的特定的被測物質。對于2種被測試樣，進行下述所示的標記化(使之具有區別)，也可以比較其差異。
與選擇結合性物質選擇性結合的、被測試樣中的對應選擇結合性物質的檢測，可以使用能夠特異性地識別結合的公知方法。例如，在檢體中的對應選擇結合性物質上結合熒光物質、發光物質、放射性同位素等標記體，選擇結合反應和洗滌后，可以檢測該標記體。關于這些標記體的種類和標記體的引入方法，沒有任何限定，可以使用以往公知的各種方法。特別是，纖維具有光透過性，使在纖維端標記的檢體反應，在另一端用檢測器進行檢測時，優選使用熒光物質或發光物質作為標記體。用于免疫測定或核酸雜交的測定的熒光物質或發光物質在本領域是公知的，市售有各種物質，因此可以使用這些市售的熒光物質或發光物質。
另外，纖維或選擇結合性物質固定用部位上固定的選擇結合性物質與被測試樣中的對應選擇結合性物質進行結合反應后，或者在結合反應的同時，使與對應選擇結合性物質選擇性結合的、被標記的游離測定用物質反應，洗滌后，測定通過對應選擇結合性物質與選擇結合性物質結合在纖維上的該測定用物質的標記，從而也可以進行。例如，作為選擇結合性物質，將具有特定堿基序列的核酸固定在纖維上，對應選擇結合性物質是含有與該核酸互補的區域的核酸時，可以將作為對應選擇結合性物質的該核酸中的同與上述選擇結合性物質互補區域以外的區域互補的核酸標記，用作測定用物質。另外，作為選擇結合性物質，將抗原固定在纖維上，對應選擇性結合物質是與該抗原進行抗原抗體反應的抗體時，可以將與該抗體進行抗原抗體反應的第2抗體標記，將得到的物質用作測定用物質。這些場合也優選在纖維的一端區域固定選擇結合性物質，使用熒光物質或發光物質作為標記，由另一端側測定反應結果。
另外，纖維或選擇結合性物質固定用部位具有電傳導性時，優選使用檢測基于電化學反應的電流值等應答的方法。此時，使在作為電極的纖維上固定的試樣和檢體在促進、抑制試樣和檢體反應的材料下進行反應，而且，該材料的全部或一部分被包含在結合的試樣與檢體中，通過測定流過反應后的電極，即纖維或選擇結合性物質固定用部位的電流值，可以檢測出試樣和檢體有無結合、結合的程度。
作為在使用本發明的纖維或纖維排列體的測定方法，或者使用適用于本發明的結合反應裝置的選擇結合性物質固定化基材的測定方法中使用的被測物質，可以例舉應需測定的核酸，例如病原菌或病毒等的基因、遺傳疾病的原因基因等及其一部分、具有抗原性的各種生物體成分、對病原菌或病毒等的抗體等，但不受這些的限定。另外，作為含有這些被測物質的檢體，可以例舉血液、血清、血漿、尿、糞便、骨髓、唾液、各種組織液等體液，或者各種飲食品及其稀釋物等，但不受這些的限定。另外，作為被測物質的核酸，可以將采用常規方法由血液或細胞提取的核酸標記，也可以是將該核酸作為模板，通過PCR等核酸擴增法擴增得到的物質。后一種情況，可以大幅提高測定靈敏度。將核酸擴增產物作為被測物質時，通過在用熒光物質等標記的三磷酸核苷酸存在下進行擴增，可以標記擴增核酸。另外，被測物質是抗原或抗體的場合，可以通過常規方法直接標記作為被測物質的抗原或抗體，或者使作為被測物質的抗原或抗體與選擇結合性物質結合后，洗滌固定了纖維或選擇結合性物質的選擇結合性物質固定部位，使該抗原或抗體與進行抗原抗體反應的標記后的抗體或抗原反應，也可以測定纖維或者選擇結合性物質固定部位上結合的標識。
使固定化物質與被測物質相互作用的步驟可以與以往完全相同地進行。反應溫度和時間根據雜交的核酸的鏈長、與免疫反應相關的抗原和/或抗體的種類等適當選擇，核酸雜交的場合，通常在50℃～70℃進行1分鐘～數小時，免疫反應的場合，通常在室溫～40℃下進行1分鐘～數小時。
通過上述方法，可以測定與固定的選擇結合性物質選擇性結合的核酸或抗體、抗原等被測物質。也就是說，作為選擇結合性物質固定了核酸的場合，可以測定具有與該核酸或其一部分互補的序列的核酸。另外，作為選擇結合性物質固定了抗體或抗原的場合，可以測定與該抗體或抗原進行免疫反應的抗原或抗體。另外，本說明書所說的“測定”包括檢測和定量兩者。
通過使用本發明，可以有效地、迅速且簡便地研究各種生物中的基因、蛋白質或糖鏈的表達。例如，將由正常人肝臟和感染肝炎病毒的肝臟提取的核酸標記后，在發明的纖維或選擇結合性物質固定化基材上固定了各種已知人體基因的纖維排列體或選擇結合性物質固定部位分別進行雜交。通過比較與正常肝臟核酸和肝炎肝臟核酸的排列體的結合程度，可以研究肝炎肝臟的基因表達的變化。
同樣，在結合了作為蛋白質的各種單克隆抗體的纖維排列體上，結合標記后的正常腦提取蛋白質和阿耳茨海默腦提取蛋白質，將結合后的蛋白質與正常蛋白質進行比較，從而可以研究阿耳茨海默腦中蛋白質的異常表達。
實施例通過下面的實施例更詳細地說明本發明。當然，本發明并不受下述實施例的限定。
實施例1為了確認在本實施例中使用的纖維或玻璃基材上確實進行了核酸的固定和雜交，對生物試樣不進行交叉反應，使用對熱穩定且雜交時不因施加的熱而分解的地高辛配基作為標記體，進行試驗。
將聚甲基丙烯酸甲酯光纖纖維(直徑250μm，長度100mm)的一端浸漬在肌動蛋白基因的核酸液(寶酒造株式會社制)(該核酸濃度10μg/ml)中，在空氣中干燥后，進行紫外線處理(使用ストラタジ-ン社制UVクロスリンカ-)，得到固定了核酸的纖維。合成與使用的核酸序列的部分互補的低聚核苷酸，用地高辛配基(DIGDigoxigenin，ロシユ·ダイアグノスティツクス株式會社)標記。
另外，在氨基引入載玻片基材上將肌動蛋白基因的核酸液(寶酒造株式會社制)(該核酸濃度10μg/ml)點樣，使各固定部位的大小達到直徑200μm，在空氣中干燥后，進行紫外線處理(使用ストラタジ-ン社制UVクロスリンカ-)，得到固定了核酸的基材。合成與使用的核酸序列的部分互補的低聚核苷酸，用地高辛配基(DIGDigoxigenin，ロシユ·ダイアグノスティツクス株式會社)標記。
將末端氨基化的低聚核苷酸分別溶解在100mM硼酸緩沖液(pH8.5)中，使終濃度為2mM。加入等量的二地高辛配基-3-O-甲基羰基-α-氨基己酸-N-羥基-琥珀酰亞胺酯(26mg/ml二甲基甲酰胺溶液)，室溫下靜置一夜。將糖原(ロシユ·ダイアグノスティツクス株式會社)作為載體，進行乙醇沉淀，風干沉淀后，溶解在100μmol的10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA中。將這樣得到的DIG標記低聚核苷酸用作試樣核酸模型。
將制作的核酸固定化纖維裝入雜交用袋中，采用常規方法(按照ロシユ·ダイアグノスティツクス株式會社，產品手冊實施)進行雜交。
另外，在雜交裝置的基臺上載置制作的核酸固定基材，采用常規方法(基于ロシユ·ダイアグノスティツクス株式會社，產品手冊進行)進行雜交。
雜交結束后，洗滌核酸固定化纖維和核酸固定化基材，然后添加抗DIG酶標記抗體溶液，進行抗原抗體反應。反應后，洗滌核酸固定化纖維和核酸固定化基材，除去未結合的抗體。添加DIG檢測試劑，使之平衡化。去掉水分，進行光信號的檢測，根據核酸的固定化，可以檢測出信號。
由此，采用沒有外加交流電場的以往方法，本發明的雜交裝置在結構或功能上沒有問題，確認確實可以用作雜交裝置。
實施例2光纖和選擇結合性物質固定基材的前處理將直徑200μm的玻璃制光纖(ホヤシヨツト(株)制)用玻璃制光纖專用刀切斷，使兩側的端面為鏡面狀態。
用純水、乙醇、NaOH的混和溶液洗滌加工的上述光纖和載玻片(76mm×26mm×1mm)(松浪硝子工業(株)制)后，用純水洗滌。再將洗滌過的面浸漬在純水、聚-L-賴氨酸(リシン)的混和溶液(組成10％聚-L-賴氨酸)中，在載玻片的表面引入氨基。
以2種核酸溶液(寶酒造(株)制，“γControl Template & PrimerSet-A”；產品編號TX803(約1000bp的γDNA片斷)，以及寶酒造(株)制，“Human TFR(1kb)Template & Primer Set”產品編號TX806(約1000bp的人運鐵蛋白受體DNA片斷))為原料，采用PCR法使各種的核酸擴增。PCR法中使用的引物使用分別與產品一起包裝的引物。將其純化，得到純化了的核酸溶液。在載玻片引入了氨基的面上將純化過的2種核酸溶液點樣，在空氣中干燥后，進行UV交聯(120mJ)，得到在核酸固定部位固定了2種核酸的核酸固定基材。接著，為了封閉未與核酸反應的載玻片表面剩余的氨基，在混和了硼酸、純水、pH調節用NaOH、琥珀酸酐、1-甲基-2-吡咯烷酮的溶液(將琥珀酸酐3g溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮187ml中，在使用之前，加入1M硼酸鈉(pH8.0)17ml溶液得到)中浸漬固定了核酸的面，振蕩。然后進行洗滌。
RNA的處理準備RNA溶液(寶酒造(株)制，“γpolyA+RNA-A”；產品編號TX802)。其具有和上述核酸之一(TX803)互補的堿基序列。將其與逆轉錄酶“Super script II”(GIBCO BRL社制；產品編號18064-071)、2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dGTP、1.0mM dTTP、Cy5-dUTP(アマシヤム·フアルマシア制，產品編號PA55022)混和，在42℃下溫育1小時，進行逆轉錄，得到整合了Cy5色素的cDNA溶液。
同樣準備RNA溶液(寶酒造(株)制，“Human TFR RNA(1kb)”產品編號TX805)，除將Cy5-dUTP變為Cy3-dUTP(アマシヤム·フアルマシア制，產品編號PA53022)以外，在與上述相同的條件下進行逆轉錄，得到整合了Cy3色素的cDNA溶液。該整合了Cy3色素的cDNA具有與上述核酸之一(TX806)互補的堿基序列。
將上述2種摻入了色素的cDNA溶液混和、純化，再溶解于緩沖液(3.4×SSC，0.1％SDS)中，得到雜交溶液。
雜交將在端面固定了1種核酸的2根光纖和上述整合了色素的cDNA溶液(雜交用溶液)裝入乙烯制袋中，密閉，使雜交溶液不蒸發。將其在65℃的條件下放置16小時。再由乙烯制袋中取出光纖，進行洗滌。
熒光檢測首先，使用光纖如下所述檢測來自Cy5的熒光。作為熒光的激發光，使用激光(波長635nm)。將該會聚的光束照射到光纖的浸漬了DNA溶液的端面上，用會聚透鏡會聚由另一端面發出的光。然后，設置二色鏡(オメガオプティカル制，產品編號XF2035)，使之與光軸成45度的角度，除去剩余的激發光。在二色鏡之后設置帶通濾波器(オメガオプティカル制，產品編號XF3076)，進一步除去剩余的激發光。在該帶通濾波器后設置光萬用表(フオトマルチメタ)(濱松ホトニクス制，產品編號H5784-02)，觀察來自Cy5色素的熒光。
其次，為了使用核酸固定化基材測定來自Cy5的熒光，如下設置光學系統。首先，作為熒光的激發光，使用激光(波長635nm)。先與光軸垂直地設置帶通濾波器(オメガオプティカル制，產品編號X1069)，除去激發光以外剩余的光。再設置二色鏡(オメガオプティカル制，產品編號XF2035)，使之與激光束的光軸成45度的角度，將該會聚的光束照射到浸漬了DNA溶液的載玻片面上。再在照射激發光側的端面側會聚由浸漬于DNA溶液中的端面返回的熒光，通過后述的二色鏡(オメガオプティカル制，產品編號XF2035)，再通過帶通濾波器(オメガオプティカル制，產品編號XF3076)，除去剩余的激發光。
來自Cy3的熒光，除使光纖、核酸固定化基材兩者以及二色鏡和帶通濾波器為Cy3用的設備(分別為オメガオプティカル制，產品編號XF1074、XF2017、XF3083)，并使照射激光的波長為532nm以外，采用與上述相同的方法進行檢測。
采用該方法，分別對于Cy5、Cy3，測定上述雜交后來自2種光纖和核酸固定部位的熒光。由浸漬于TX803核酸溶液而制作的光纖，僅觀察到Cy5的熒光，沒有檢測出Cy3的熒光。由浸漬于TX806核酸溶液而制作的光纖和點樣了TX806核酸溶液的核酸固定部位，僅可以觀察到Cy3的熒光，沒有檢測到來自Cy5的熒光。
實施例3使實施例2的光纖成束，掃描激發光的光束，檢測來自各光纖的熒光，除此以外，進行與實施例2相同的測定。結果，得到與實施例2相同的結果。
實施例4使照射激發光即激光的光纖的端面為未浸漬于DNA溶液中的端面，除此以外，進行與實施例2相同的測定。也就是說，使檢測熒光時光纖的方向與實施例2相反，除此以外，與實施例2相同。結果，得到與實施例2相同的結果。
實施例5光纖、核酸的處理與實施例2同樣進行。
為了測定來自Cy5的熒光，如下設置光學系統(參照圖5)。首先，作為熒光的激發光，使用激光26(波長635nm)。先與光軸垂直地設置帶通濾波器19(オメガオプティカル制，產品編號X1069)，除去激發光以外剩余的光。再設置二色鏡20(オメガオプティカル制，產品編號XF2035)，使之與激光束的光軸成45度的角度，將該會聚的光束照射到與浸漬于DNA溶液中的端面相對的光纖端面上。再在照射激發光側的端面側會聚由浸漬于DNA溶液中的端面返回的熒光，通過如上所述的二色鏡20(オメガオプティカル制，產品編號XF2035)，再通過帶通濾波器21(オメガオプティカル制，產品編號XF3076)，除去剩余的激發光。另外，圖5中，22表示會聚透鏡，23表示光纖，24表示試樣(DNA)，25表示光電倍增管。
來自Cy3的熒光，除使二色鏡和帶通濾波器為Cy3用的設備(分別為オメガオプティカル制，產品編號XF1074、XF2017、XF3083)，并使照射激光的波長為532nm以外，采用與上述相同的方法進行檢測。
采用該方法，分別對于Cy5、Cy3，測定上述雜交后來自2種光纖的熒光。由浸漬于TX803核酸溶液而制作的光纖，僅觀察到Cy5的熒光，沒有檢測出Cy3的熒光。由浸漬于TX806核酸溶液而制作的光纖，僅可以觀察到Cy3的熒光，沒有檢測到來自Cy5的熒光。
實施例6將光纖制成多個細光纖捆扎得到的導象管(エドモンド·オプティツクス·ジヤパン制，產品編號CJ53843)。該導象管是將3012根粗細為25μm的石英制光纖捆扎制成的。
光纖、核酸的處理與實施例5同樣進行。另外，檢測光學系統與實施例5相同。此時，由浸漬于TX803核酸溶液而制作的光纖，僅觀察到Cy5的熒光，沒有檢測出Cy3的熒光。由浸漬于TX806核酸溶液而制作的光纖，僅可以觀察到Cy3的熒光，沒有檢測到來自Cy5的熒光。另外，如果實施例5的來自Cy5、Cy3的熒光的強度為1，則本實施例的試驗中，熒光的強度為3，S/N更高。認為其理由是因為如果使用導象管，會聚的光在光纖內部不發散，能夠有效地將激發光送到試樣。
實施例7光纖的處理在實施例1使用的直徑為200μm的玻璃制光纖(ホヤシヨツト制)上通過濺射涂覆Pt膜，得到具有導電性的光纖。再用玻璃制光纖專用刀切斷，使兩側的端面為鏡面狀態。再將端面浸漬在純水、聚-L-賴氨酸的混和溶液(組成10％聚-L-賴氨酸)中，在光纖的一個端面上引入氨基。
然后，核酸等的處理與實施例2同樣進行，分別得到在端面上固定了1種核酸的2根光纖和雜交用溶液。
雜交將在端面上固定了1種核酸的2根光纖和整合了Cy5、Cy3色素的cDNA溶液(雜交用溶液)裝入微管(1.5ml)中。再在微管的蓋上開孔，在其中穿過光纖，將固定了DNA的光纖的端面浸漬在微管內的雜交溶液中。用紙帶將微管蓋上的孔密封，進行密閉，使溶液不蒸發。此時的雜交溶液為50μl。另外，溶液的組成為在純水中溶解標記了熒光體的DNA。將其在65℃的條件下放置10分鐘。此時，在微管的底面貼附銅箔，將光纖作為陽極，將微管底的銅箔作為陰極，外加100V的電壓。再由微管取出光纖，洗滌。與實施例2同樣測定光時，由浸漬于TX803核酸溶液而制作的光纖，僅觀察到Cy5的熒光，沒有檢測出Cy3的熒光。由浸漬于TX806核酸溶液而制作的光纖，僅可以觀察到Cy3的熒光，沒有檢測到來自Cy5的熒光。此時的熒光強度與實施例2相同。另一方面，使光纖的條件與實施例2相同(即未外加電壓的狀態)，使雜交時間為10分鐘時，熒光的強度為實施例2的1/3。這樣可知，如果光纖具有導電性，外加電場，則即使僅10分鐘的雜交時間，也是充分的。
實施例8選擇結合性物質固定基材的前處理為了在選擇結合性物質排列基材上形成導電電極，在載玻片上靠近安裝2個設有開口部的不銹鋼制掩膜，使10mm×5mm的開口的10mm邊間隔10mm的間隔平行對峙，通過濺射法在載玻片上設置相當于上述掩膜開口部形狀的金電極。
將這樣設置有金電極的載玻片(76mm×26mm×1mm)(松浪硝子工業(株)制)用純水、乙醇、NaOH的混和溶液洗滌后，用純水洗滌。再將洗滌過的面浸漬在純水、聚-L-賴氨酸的混和溶液(組成10％聚-L-賴氨酸)中，在載玻片的表面引入氨基。
以2種核酸溶液(寶酒造(株)制，“γControl Template & PrimerSet-A”；產品編號TX803(約1000bp的γDNA片斷)，以及寶酒造(株)制，“Human TFR(1kb)Template & Primer Set”產品編號TX806(約1000bp的人運鐵蛋白受體DNA片斷))為原料，采用PCR法使各種核酸擴增。PCR法中使用的引物使用分別與產品一起包裝的引物。將其純化，得到純化了的核酸溶液。在載玻片的上述金電極之間的引入了氨基的面上點樣純化過的2種核酸溶液，在空氣中干燥后，進行UV交聯(120mmJ)，得到在核酸固定部位固定了2種核酸的核酸固定化基材。接著，為了封閉未與核酸反應的載玻片表面剩余的氨基，在混和了硼酸、純水、pH調節用NaOH、琥珀酸酐、1-甲基-2-吡咯烷酮的溶液(將琥珀酸酐3g溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮187ml中，在使用之前，加入1M硼酸鈉(pH8.0)17ml溶液得到)中浸漬固定了核酸的面，振蕩。然后進行洗滌。
RNA的處理準備RNA溶液(寶酒造(株)制，“γpolyA+RNA-A”；產品編號TX802)。與實施例2的RNA處理同樣進行，得到整合了Cy5色素的cDNA溶液以及雜交溶液。
雜交將在表面固定了2種核酸的核酸固定化基材固定在雜交裝置的基臺上，連接在核酸固定部位的兩側設置的金電極和雜交裝置的交流電壓外加手段。在固定了2種核酸的部位滴加2μl的上述雜交溶液，在核酸固定部位兩側的導電電極上架設蓋板，密閉，使雜交溶液不蒸發。再在上述導電電極之間外加10V、10Hz的交流電壓，在65℃的條件下靜置10分鐘后，取下蓋板、導電電極，洗滌。
熒光檢測為了測定來自Cy5和Cy3的熒光，光學系統與實施例2的光學系統相同，檢測來自Cy5和Cy3的熒光。
采用該方法，對于Cy5、Cy3，分別測定上述來自雜交后的2種核酸固定部位的熒光。由點樣了TX803核酸溶液的核酸固定部位，僅觀察到Cy5的熒光，不能檢測出Cy3的熒光。由點樣了TX806核酸溶液的核酸固定部位，僅觀察到Cy3的熒光，不能檢測出來自Cy5的熒光。
另外可知，由此時外加交流電壓的核酸固定化基材得到的熒光強度與未外加交流電壓長時間雜交的以往的方法相比，即使與外加直流電壓的場合相比，在低電壓下，也可以得到相同的效果。
實施例9為了驗證在選擇結合性物質固定化基材上不形成導電電極，在選擇結合反應裝置上具有導電電極時的效果，用純水、乙醇、NaOH的混和溶液洗滌載玻片(76mm×26mm×1mm)(松浪硝子工業(株)制)后，用純水洗滌。再將洗滌過的面浸漬在純水、聚-L-賴氨酸的混和溶液(組成10％聚-L-賴氨酸)中，在載玻片的表面引入氨基，與實施例8同樣進行核酸的固定化、RNA的處理。
接著，為了使用核酸固定化基材確認外加交流電壓的效果，進行下述試驗。將在表面固定了2種核酸的核酸固定化基材固定在雜交裝置的基臺上，在固定了核酸的區域的兩側設置與雜交裝置的交流電壓外加手段連接的導電電極。在本實施例中，使用厚度0.15mm的金薄板作為導電電極。導電電極的間隔為1cm。在固定了2種核酸的部位滴加20μl的上述雜交溶液，在核酸固定部位兩側的導電電極上架設蓋板，密閉，使雜交溶液不蒸發。再在上述導電電極之間外加10V、10Hz的交流電壓，在65℃的條件下靜置10分鐘后，取下蓋板、導電電極，洗滌。
為了與不外加交流電壓的以往方法進行比較，作為與外加交流電壓的試樣對應的試樣，準備在導電電極間未外加電壓狀態下于65℃的條件下放置16小時的試樣。在65℃放置16小時后，取下蓋板、導電電極，洗滌。
熒光檢測與實施例8相同，檢測來自Cy5和Cy3的熒光，由點樣了TX803核酸溶液的核酸固定部位，僅觀察到Cy5的熒光，不能檢測出Cy3的熒光。由點樣了TX806核酸溶液的核酸固定部位，僅觀察到Cy3的熒光，不能檢測出來自Cy5的熒光。
另外，可以得知由此時外加了交流電壓的核酸固定化基材得到的熒光強度能夠得到與在雜交裝置側具有導電電極的場合相同的結果。
權利要求
1.一種纖維或含有該纖維的束的纖維排列體，其固定了選擇結合性物質。
2.權利要求1所述的纖維或含有該纖維的束的纖維排列體，上述選擇結合性物質是核酸、蛋白質、糖類或抗原性化合物。
3.權利要求2所述的纖維或含有該纖維的束的纖維排列體，上述選擇結合性物質是核酸、抗體或抗原。
4.權利要求1～3中任意一項所述的纖維或含有該纖維的束的纖維排列體，上述纖維具有光透過性。
5.權利要求1～3中任意一項所述的纖維和含有該纖維的束的纖維排列體，上述纖維具有電傳導性。
6.權利要求1～5中任意一項所述的固定纖維和含有該纖維的束的纖維排列體，其特征在于，具有柔性。
7.權利要求1～6所述的纖維和含有該纖維的束的纖維排列體，其特征在于，在纖維端固定上述選擇結合性物質。
8.權利要求1～7所述的纖維排列體，在纖維排列體的全部或一部分，上述選擇結合性物質的種類不同。
9.權利要求8所述的纖維排列體，固定了上述選擇結合性物質的各纖維可以區別。
10.權利要求1～9中任意一項所述的纖維排列體，可以直接通過纖維檢測與固定的選擇結合性物質反應的物質。
11.權利要求1～10中任意一項所述的纖維排列體，其特征在于，上述纖維為光纖。
12.一種選擇結合反應的結果的測定方法，使含有對應選擇結合性物質的被測試樣對權利要求1～11中任意一項所述的纖維排列體發生作用，洗滌后，測定與該纖維結合的上述對應選擇結合性物質，其中，上述對應選擇結合性物質與固定在該纖維排列體的纖維上的上述選擇結合性物質選擇性結合。
13.權利要求12所述的方法，上述纖維具有光透過性，上述選擇結合性物質固定在纖維的一端部。
14.權利要求13所述的方法，上述對應選擇結合性物質被熒光或發光物質標記，或者是與被熒光或發光物質標記的測定用物質選擇性結合的物質，反應和洗滌后，由上述纖維的另一端側測定上述對應選擇結合性物質或上述測定用物質的標記所用的熒光或發光物質發出的熒光或發光。
15.一種方法，在權利要求5所述的纖維排列體上外加電壓或電流，使該纖維排列體的纖維上固定的上述選擇結合性物質與含有對應選擇結合性物質的被測試樣選擇性結合。
16.一種選擇結合性物質與對應選擇結合性物質的結合反應方法，在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液和上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質進行結合反應，在該步驟中，使上述被測試樣液和/或上述對應選擇結合性物質相對于固定了上述選擇結合性物質的面相對移動。
17.權利要求16所述的方法，在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液和上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質進行結合反應，在該步驟中，在與固定了上述選擇結合性物質的面的垂直軸交叉的方向，且上述選擇結合性物質固定化區域兩端的外側設置的導電電極間外加交流電壓，同時進行上述結合反應。
18.權利要求16或17所述的方法，上述選擇結合性物質固定化區域存在多個，存在其排列而成的選擇結合性物質排列區域，在該選擇結合性物質排列區域兩端的外側設置上述導電電極。
19.權利要求16至18中任意一項所述的方法，上述選擇結合性物質是選自核酸、蛋白質、糖類、抗體或抗原性化合物中的至少一種。
20.權利要求19所述的方法，上述選擇結合性物質和上述對應選擇結合性物質是單鏈核酸，上述結合反應是核酸間的雜交。
21.一種選擇結合反應裝置，是在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液和上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質進行結合反應的裝置，具有設置上述基材的基臺；在與固定了上述選擇結合性物質的面的垂直軸交叉的方向，且在上述選擇結合性物質固定化區域兩端的外側設置的導電電極；以及在該導電電極間外加交流電壓的交流電壓外加手段。
22.一種選擇結合性物質固定用基材，是用于在基材上固定選擇結合性物質，使含有與上述選擇結合性物質選擇性結合的對應選擇結合性物質的被測試樣液和上述固定化選擇結合性物質接觸，使上述選擇結合性物質與上述對應選擇結合性物質進行結合反應的上述基材，具有固定基材上的選擇結合性物質的選擇結合性物質固定用部位，以及在選擇結合性物質固定用區域兩端的外側設置的導電電極。
23.權利要求22所述的基材，上述選擇結合性物質固定用部位存在多個，存在其排列而成的選擇結合性物質排列區域，在該選擇結合性物質排列區域兩端的外側設置上述導電電極。
24.權利要求22或23所述的選擇結合性物質固定用基材，上述選擇結合性物質固定用部位為在基材上設置的凸部或凹部。
25.權利要求24所述的基材，上述選擇結合性物質固定用部位是插入設置于上述基材上的孔中的纖維或該纖維的束的端部。
26.權利要求22至25所述的基材，選擇結合性物質固定在上述選擇結合性物質固定用部位上。
27.權利要求22至26中任意一項所述的基材，上述選擇結合性物質是選自核酸、蛋白質、糖類、抗體或抗原性化合物中的至少一種。
28.權利要求27所述的基材，上述選擇結合性物質和上述對應選擇結合性物質是單鏈核酸，上述結合反應是核酸間的雜交。
29.權利要求22至28中任意一項所述的基材，上述導電電極的材質是選自鉑、金、銀、鋁、銅、鈀的金屬單質或它們的合金、碳或碳化合物、或者導電性聚合物中的至少一種。
全文摘要
本發明公開了一種固定了選擇結合性物質的排列體，其可以不依賴于位置關系地區分識別各個試樣，可以組合任意的排列體，另外可以根據使用方法自由改變密度，且簡便地檢測出結合的試樣和其他試樣的反應。本發明提供固定了選擇結合性物質的纖維或含有該纖維的束的纖維排列體。另外，提供一種選擇結合性物質和對應選擇結合性物質的結合反應的方法，其通過在選擇結合反應步驟中，在與固定選擇結合性物質的面的垂直軸交叉的方向上外加交流電壓等方法，使上述被測試樣液和/或上述對應選擇結合性物質相對于固定了上述選擇結合性物質的面相對移動。
文檔編號B01J19/00GK1496480SQ02806339
公開日2004年5月12日 申請日期2002年1月11日 優先權日2001年1月12日
發明者曾根三郎, 久, 薙野邦久, 史, 日笠雅史, 二, 信正均, 渡邊幸二 申請人:東麗株式會社