專利名稱：離子鈣診斷/測定試劑盒及離子鈣濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種離子鈣診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定離子鈣濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液中的鈣幾乎全部存在于血漿中，血漿鈣有兩種形式1非擴散性鈣，也稱結合鈣。它同蛋白質結合，不能透過毛細血管壁，不具有生理活性，約占鈣的40％；2可擴散性鈣，包括離子化鈣，約占總鈣的46％，是具有生理活性的部分。與碳酸氫根、磷酸鹽、檸檬酸、乳酸等陰離子結合的鈣，約占總鈣的14％。非擴散性鈣與擴散性鈣可以互相轉變并保持動態平衡。
鈣的生理功能主要為1構成骨骼和牙齒，維持和修補骨骼的完整性；2保持神經肌肉的正常應激性；3傳導神經沖動；4維持細胞的正常生理通透性；5參與血疑過程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脫氫酶、ATP酶等；7對心肌收縮的影響，ca2+有利于心肌收縮，它和有利于心肌舒張的K+相拮抗，從而維持心肌正常的收縮與舒張。血鈣與骨骼中的鈣保持動態平衡。血鈣含量的變化常能反映出骨組織的代謝情況，因此測定血鈣對某些疾病的診斷有幫助。
總鈣的測定方法很多，概括起來有滴定法(氧化還原滴定法、絡合滴定法)，比色法(方法很多，最常用又便與自動化操作的是鄰甲酚酞合絡酮法、甲基麝香草酚藍法、偶氮胂III法等)，火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀釋質譜法、酶法。國際臨床化學聯合(IFCC)推薦的鈣測定決定性方法為同位素稀釋質譜法(IDMS)，參考方法為原子吸收分光光度法。世界衛生組織(WHO)推薦的中等實驗室用的常規方法為鄰甲酚酞絡合酮法(O-CPC)。
離子鈣的測定方法大致有生物學法、透析法、超濾法、金屬指示劑法、離子選擇性電極法.目前應用最多的是離子選擇性電極法(ISE)。此方法簡便、迅速、重復性好，正確和敏感性高。測定結果不受血漿蛋白質的影響，能反映機體鈣代謝的實際情況。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯法(Couple Reaction)技術，連續監測通過酶聯反應生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，所導致在400-700nm波長處吸光度的上升，得以測定離子鈣濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的離子鈣診斷/測定試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行離子鈣濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明離子鈣濃度測定方法原理如下 還原型輔酶+氧NAD(P)H氧化酶/Ca2+輔酶+過氧化氫 過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水 這種方法應用NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)需要鈣離子才能激活酶活性的酶促反應速率比色法。在鈣離子的催化下，NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)酶解反應產生過氧化氫，再通過(偶)聯合過氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)的作用，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通過測量400-700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的速度，得出離子鈣濃度大小測定結果。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，如下成分關系的本發明離子鈣濃度診斷/測定試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 還原型輔酶 0.25mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 過氧化物酶15000U/L 還原型色原體組合 6mmol/L 所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任一個組合 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，2’-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺 4-氨基抗砒 石碳酸 4-氨基抗砒 N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺 4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺 4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸 4-氨基抗砒 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸 4-氨基抗砒 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸 4-氨基抗砒 雙甲基苯胺 4-氨基抗砒 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒 2，2’-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺 本發明的離子鈣濃度診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶、還原型輔酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗干擾劑。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩定劑、還原型色原體組合、抗干擾劑、還原型輔酶。
試劑2 緩沖液、穩定劑、過氧化物酶、NAD(P)H氧化酶。
NAD(P)H氧化酶、還原型輔酶、過氧化物酶、還原型色原體組合在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、抗干擾劑。
試劑2 緩沖液、穩定劑、過氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶。
NAD(P)H氧化酶、還原型輔酶、過氧化物酶、還原型色原體組合在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式 下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的離子鈣濃度診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 還原型輔 酶0.25mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 過氧化物酶30000U/L 4-氨基抗砒2mmol/L 石碳酸10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長505nm，測試副波長600nm，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣濃度大小。
實施例二 本實施例的離子鈣濃度診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 還原型輔酶 0.25mmol/L 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0.2mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 過氧化物酶 25000U/L 4-氨基抗砒 0.6mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/20，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣濃度大小。
實施例三 本實施例的離子鈣濃度診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 還原型輔酶 0.25mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 過氧化物酶15000U/L 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑50mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 雙甲基苯胺2mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長578nm，測試副波長660nm，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/30，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣濃度大小。
申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質量污染。
權利要求
1.一種離子鈣濃度的測定方法，其方法原理如下
將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，得出離子鈣濃度大小測定結果。
2.一種離子鈣診斷/測定試劑盒，主要成分包括
緩沖液 20——500mmol/L
穩定劑 1——50mmol/L
還原型輔酶 0.1——0.35mmol/L
NAD(P)H氧化酶 2000——20000U/L
過氧化物酶 500——500000U/L
還原型色原體組合0.1——20mmol/L
其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)、還原型輔酶、過氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成單劑試劑。
4.根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)、還原型輔酶、過氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、還原型色原體組合及抗干擾劑組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶、過氧化物酶組成。NAD(P)H氧化酶、還原型輔酶、過氧化物酶、還原型色原體組合在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5.根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)、還原型輔酶、過氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、還原型色原體組合及抗干擾劑組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、過氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶組成。NAD(P)H氧化酶、還原型輔酶、過氧化物酶、還原型色原體組合在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑1-4000mmol/L或0.1％-100％體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
7.根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個組合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的離子鈣診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定離子鈣濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、NAD(P)H氧化酶、還原型輔酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩定劑及抗干擾劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出離子鈣濃度的大小。
文檔編號G01N33/84GK101169435SQ20061009720
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優先權日2006年10月24日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司