專利名稱：離子鈣診斷/測定試劑盒及離子鈣濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種離子鈣診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定 離子鈣濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液中的鈣幾乎全部存在于血漿中，血漿鈣有兩種形式l非擴散 性鈣，也稱結合鈣。它同蛋白質結合，不能透過毛細血管壁，不具有生 理活性，約占鈣的40%; 2可擴散性鈣，包括離子化鈣，約占總f丐的 46%，是具有生理活性的部分。與碳酸氫根、磷酸鹽、檸檬酸、乳酸等 陰離子結合的鈣，約占總鈣的14%。非擴散性鈣與擴散性鈣可以互相 轉變并保持動態平衡。
鈣的生理功能主要為1構成骨骼和牙齒，維持和修補骨骼的完整
性；2保持神經肌肉的正常應激性；3傳導神經沖動；4維持細胞的正
常生理通透性；5參與血疑過程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脫氫
酶、ATP酶等；7對心肌收縮的影響，ca2+有利于心肌收縮，它和有利于 心肌舒張的K+相拮抗，從而維持心肌正常的收縮與舒張。血轉與骨骼中
的鈣保持動態平衡。血鈣含量的變化常能反映出骨組織的代謝情況，因 此測定血鈣對某些疾病的診斷有幫助。
總鈣的測定方法很多，概括起來有滴定法(氧化還原滴定法、絡合滴 定法)，比色法(方法很多，最常用又便與自動化操作的是鄰甲酚酞合
絡酮法、甲基麝香草酚藍法、偶氮胂in法等)，火焰光度法、原子吸收
分光光度法、同位素稀釋質譜法、酶法。國際臨床化學聯合(IFCC)推 薦的鈣測定決定性方法為同位素稀釋質譜法(IDMS)，參考方法為原子 吸收分光光度法。世界衛生組織(WHO)推薦的中等實驗室用的常規方法 為鄰甲酚酞絡合酮法(O-CPC)。
離子鈣的測定方法大致有生物學法、透析法、超濾法、金屬指示 劑法、離子選擇性電極法.目前應用最多的是離子選擇性電極法(ISE)。 此方法簡便、迅速、重復性好，正確和敏感性高。測定結果不受血漿 蛋白質的影響，能反映機體鈣代謝的實際情況。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶擴增法(Enzymatic doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定離子鈣濃度的方法，同時， 本發明還將給出用以實現該方法的離子鈣診斷/測定試劑盒，采用該試 劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行離子 鈣濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣 應用。
本發明離子鈣濃度測定方法原理如下
還原型輔酶+氧NAD(P)H氧化酶/(>2+輔酶+過氧化氫 過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+ 2水
這種方法應用NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase ; EC 1.6.3.l)需
要鈣離子才能激活酶活性的酶促反應速率比色法，加上利用NADH過 氧化物酶(NADH peroxidase ; EC 1.11.U ; EC 1.11.1.2)的加倍擴增作 用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度 下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算離子鈣 濃度的大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明離子鈣診斷/ 測定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
NAD(P)H氧化酶 12000 U/L
NADH過氧化物酶 16000 U/L
本發明的離子鈣診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧
化物酶。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧化物酶。 還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試 劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、NADH過氧化物酶。
還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定離子鈣濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的離子鈣診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩定劑 還原型輔酶
50 mmol/L
0.25 mmol/L
NAD(P)H氣化酶 12000 .
NADH過氧化物酶 16000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37i:，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測離子 鈣樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延 遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出離子鈣 的濃度大小。 實施例二
本實施例的離子鈣診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑 還原型輔f
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
50 mmol/L
NAD(P)H氧化酶 10000 U/L
NADH過氧化物酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測離子 鈣樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下 降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出離子鈣 的濃度大小。 實施例三
本實施例的離子鈣診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑 還原型輔酶
50 mmol/L
0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmd/L
穩定劑
NAD(P)H氣化酶 試劑3
50 mmol/L 16000 U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑 50 mmol/L
NADH過氣化物酶 20000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定離子鈣濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反 應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測離子鈣樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右， 檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出離子鈣 的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權利要求
1.一種利用酶擴增法、酶比色法及酶聯法技術的離子鈣濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972040002C1.gif" wi="132" he="16" top= "49" left = "36" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出離子鈣的濃度大小測定結果。
2. —種離子鈣診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-穩定劑 1-還原型輔酶 o.i-NAD(P)H氧化酶 1OOO—-500 mmol/L -50 mmol/L-0.35 mmol/L-80000 U/LNADH過氧化物酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧 化物酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧 化物酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧 化物酶組成。還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧化物酶 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧 化物酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組 成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、NAD(P)H氧化酶組成；試劑3， 由緩沖液、穩定劑、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、NAD(P)H 氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶擴增法、酶比色法及酶聯法技術的離子鈣診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定離子鈣濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、NAD(P)H氧化酶、NADH過氧化物酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出離子鈣的濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101169436SQ20061009720
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優先權日2006年10月24日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司