專利名稱：離子鈣診斷/測定試劑盒及離子鈣濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種離子鈣診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定 離子鈣濃度的方法，屬于醫學/食品/檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液中的鈣幾乎全部存在于血漿中，血漿鈣有兩種形式l非擴散 性鈣，也稱結合鈣。它同蛋白質結合，不能透過毛細血管壁，不具有生 理活性，約占鈣的40%; 2可擴散性鈣，包括離子化鈣，約占總f丐的 46%，是具有生理活性的部分。與碳酸氫根、磷酸鹽、檸檬酸、乳酸等 陰離子結合的鈣，約占總鈣的14%。非擴散性鈣與擴散性鈣可以互相 轉變并保持動態平衡。
鈣的生理功能主要為1構成骨骼和牙齒，維持和修補骨骼的完整 性；2保持神經肌肉的正常應激性；3傳導神經沖動；4維持細胞的正 常生理通透性；5參與血疑過程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脫氫 酶、ATP酶等；7對心肌收縮的影響，ca2+有利于心肌收縮，它和有利于 心肌舒張的K+相拮抗，從而維持心肌正常的收縮與舒張。血轉與骨骼中 的鈣保持動態平衡。血鈣含量的變化常能反映出骨組織的代謝情況，因 此測定血鈣對某些疾病的診斷有幫助。
總鈣的測定方法很多，概括起來有滴定法(氧化還原滴定法、絡合滴 定法)，比色法(方法很多，最常用又便與自動化操作的是鄰甲酚酞合
絡酮法、甲基麝香草酚藍法、偶氮胂m法等)，火焰光度法、原子吸收
分光光度法、同位素稀釋質譜法、酶法。國際臨床化學聯合(IFCC)推 薦的鈣測定決定性方法為同位素稀釋質譜法(IDMS)，參考方法為原子 吸收分光光度法。世界衛生組織(WHO)推薦的中等實驗室用的常規方法 為鄰甲酚酞絡合酮法(O-CPC)。
離子鈣的測定方法大致有生物學法、透析法、超濾法、金屬指示 劑法、離子選擇性電極法.目前應用最多的是離子選擇性電極法(ISE)。 此方法簡便、迅速、重復性好，正確和敏感性高。測定結果不受血漿 蛋白質的影響，能反映機體鈣代謝的實際情況。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續 監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定離子鈣濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法 的離子鈣診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀 或半、全自動生化分析儀上進行離子鈣濃度測定，而且測定速度快、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明離子鈣濃度測定方法原理如下
磷脂+水磷脂酶-A2/Ca^1-酰基甘油磷基膽堿+甲酸 甲酸+輔酶甲酸脫氫酶二氧化碳+還原型輔酶 這種方法應用需要鈣離子才能激活的磷脂酶-A2 (phospholipase A2 ; EC 3丄1.4)酶(偶)聯甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase ; EC 1.2丄2 ; EC 1.2丄43)酶促反應連續監測法。磷脂酶-A2酶解磷脂反 應產生1-酰基甘油磷基膽堿(l-acylglycerophosphocholine)及甲酸， 再通過(偶)聯合甲酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有 吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測 定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光 度上升的程度，可以測算離子鈣的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明離子鈣診斷/
測定試劑盒較為理想
緩沖液 10Ommol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
磷脂 16mmol/L
磷脂酶-A2 10000 U/L
甲酸脫氫酶 16000 U/L
本發明的離子鈣診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、輔酶、磷脂。試劑2
緩沖液、穩定劑、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶。 輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、磷脂。 試劑3
緩沖液、穩定劑、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶。 輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3
中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使
用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定離子鈣濃度的方法，其輔
酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的離子鈣診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑
輔酶
磷脂
磷脂酶-A2 甲酸脫氫酶
50 mmol/L 3 mmol/L 16 mmol/L
10000U/L
16000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測離子鈣 樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲 時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣 的濃度大小。 實施例二
本實施例的離子鈣診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
磷脂
廳mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 12 mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑 磷脂酶-A2
甲酸脫氫酶
50 mmol/L 16000U/L 26000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測離子鈣 樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升 反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣 的濃度大小。 實施例三
本實施例的離子鈣診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L
磷P
曰
26 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L
磷脂酶-A2 20000 U/L
甲酸脫氫酶 36000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定離子鈣濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反 應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm,測試副波長 405nm，被測離子鈣樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約l分鐘左右， 檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣 的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權利要求
1.一種酶循環擴增法、酶比色法的離子鈣的濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972060002C1.gif" wi="128" he="16" top= "48" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出離子鈣的濃度大小測定結果。
2. —種離子鈣診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1——50 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L磷脂 1- 50mmol/L磷脂酶-A2 1000-80000 U/L甲酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶組成單 劑試劑。
4. 根據權利要求2所述離子^診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶、磷脂組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶組成。輔酶、磷脂、 磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶組成多 劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖 液、磷脂組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、磷脂酶-A2、甲酸脫 氫酶組成。輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶在試劑l、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述離子鈣診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩定劑1—-4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的離子鈣診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定離子鈣濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、磷脂、磷脂酶-A2、甲酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出離子鈣的濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101169438SQ20061009720
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優先權日2006年10月24日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司