專利名稱：適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法
技術領域：
本發明涉及一種適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法，屬農藥快速檢測領域。
背景技術：
目前，國內外研究的快速檢測農藥殘留的方法主要有酶聯免疫吸附分析法、酶片法(速測卡法)、農藥殘留分光光度計法和生物傳感器法等。這些方法大多是通過檢測酶催化反應得到的電化學活性物質或有色物質的多少，來反映樣品中的農藥殘留的高低。然而，由于食品樣品的組分多樣性，這種方法容易受樣品中其他電化學活性物質或光學物質的干擾，造成結果的不準確性。
利用生化反應過程中普遍伴隨的熱量變化，采用量熱的方式來進行分析，具有通用性強、適用于大多數生化樣品、在測量時不受其他電化學活性物質或光學物質的干擾等優點。然而，由于生化反應產生的熱量往往比較小，難以測量。因此，目前國內外在檢測農藥方面，很少采用量熱式的方法。
本申請人曾基于量熱原理，于2002年11月獲得了一項名為“一種探測農藥殘留用的量熱式生物傳感器”的實用新型專利(CN2519909)。該專利裝置主要由參考酶柱、檢測酶柱、流動單元和檢測單元組成，通過檢測兩酶柱出口液體的溫度差和標定，獲知樣液中的農藥殘留高低。但也由于利用的膽堿酯酶催化的生化反應放出熱量過小，增加了檢測難度，降低了檢測準確度。
發明內容
本發明的目的是為了克服現有快速檢測農藥殘留方法中，由于食品樣品的組分多樣性，容易受樣品中其他電化學活性物質或光學物質的干擾，造成結果的不準確性的缺點，提供一種生化反應產生的熱量大，易測量的適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法。
本發明的技術方案是一種適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法，其特點是，所述的生物敏感元件由從動植物體中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1、酶液的提取動物組織按1∶3的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎；或植物組織干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的緩沖液，進行攪拌提取；離心分離得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎、離心分離得酚氧化酶粗酶液；2、酶的部分純化用30％和80％飽和度的硫酸銨溶液依次對B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液進行分級沉淀，之后用超濾除去小分子鹽；
3、酶的固定化將部分純化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，與處理好的OH型陰離子交換樹脂一起攪拌固定，4-5小時后，用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于中性緩沖液中待用。
本方法制作的生物敏感元件由從動植物體中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成。前者能專一性地被有機磷和氨基甲酸酯類農藥抑制，后者能催化前者催化產生的水解產物——酚類物質的氧化。其原理示意圖為 其中Q1和Q2分別為反應(1)和(2)兩個過程中放出的熱量。利用有機磷和氨基甲酸酯類農藥對B-酯酶的抑制作用，采用與未受抑制的同種酶體系的反應放熱對比的方法，測得熱量之差(ΔQ)。通過標定，這個熱量差就反映食品中農藥殘留的濃度。本發明的有益效果是由于由本方法制作的生物敏感元件利用酶聯級反應(反應1和2)將ΔQ由原來的ΔQ1提高到了Δ(Q1+Q2)，大大提高了量熱式農藥檢測的靈敏度。
圖1為酶催化反應的熱流曲線。
圖中A固定化B-酯酶，未經敵敵畏(1mg/L)溶液抑制，催化的生化反應的熱流曲線；B本發明制備的固定化生物敏感元件(含B-酯酶和酚氧化酶)，未經敵敵畏(1mg/L)溶液抑制，催化的生化反應的熱流曲線；A’固定化B-酯酶，經敵敵畏(1mg/L)溶液抑制后，催化的生化反應的熱流曲線；B’本發明制備的固定化生物敏感元件(含B-酯酶和酚氧化酶)，經敵敵畏(1mg/L)溶液抑制后，催化的生化反應的熱流曲線。
具體實施例方式
一種適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法，其特點是該生物敏感元件由從動植物體中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1、酶液的提取本實施例中動物組織采用動物的肝臟按1∶3的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎；或植物組織采用小麥干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的緩沖液，進行攪拌提取；離心分離得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎、離心分離得酚氧化酶粗酶液；2、酶的部分純化用30％和80％飽和度的硫酸銨溶液依次對B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液進行分級沉淀，之后用超濾除去小分子鹽；
3、酶的固定化將部分純化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，與處理好的OH型陰離子交換樹脂一起攪拌固定，4-5小時后，用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于中性緩沖液中待用。
具體試驗實例以1mg/L(相當于1ppm)的敵敵畏標準溶液為樣液，分別通過固定化B-酯酶和本發明制備的固定化生物敏感元件；用micro-DSCIII微量量熱儀，測量通過后的這兩類酶體系催化反應的放熱量，并與無樣液通過的酶體系的反應放熱比較，得到以下曲線。其具體操作條件如下反應溫度40℃； 反應pH6.4磷酸緩沖液；流速0.3ml/min；底物50μl的80mmol/Lα-乙酸萘酯溶液；由圖1所示曲線積分可知，lmg/L的敵敵畏引起B-酯酶催化反應的熱量變化(即曲線A的積分面積-曲線A’的積分面積)僅為0.003mJ(mW*s)，而它引起本發明制備的固定化生物敏感元件催化反應的熱量變化(即曲線B的積分面積-曲線B’的積分面積)卻為0.1mJ(mW*s)。與單獨使用B-酯酶相比，由相同農藥濃度引起的熱量變化提高了33倍左右，這大大降低了測熱的難度。這是因為，當樣液中存在農藥時，B-酯酶的活性受到抑制，酚的產量降低，放熱量Q1減少；反應式(2)的反應放熱量Q2也隨著酚濃度的降低而減少，從而使得與使用單級B-酯酶相比，由相同農藥濃度引起的熱量變化大幅度升高。
權利要求
1.一種適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法，其特點是該生物敏感元件由從動植物體中提取的B-酯酶和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1)酶液的提取動物組織按1∶3的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎；或植物組織干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的緩沖液，進行攪拌提取；離心分離得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎、離心分離得酚氧化酶粗酶液；2)酶的部分純化用30％和80％飽和度的硫酸銨溶液依次對B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液進行分級沉淀，之后用超濾除去小分子鹽；3)酶的固定化將部分純化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，與處理好的OH型陰離子交換樹脂一起攪拌固定，4-5小時后，用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于中性緩沖液中待用。
全文摘要
本發明公開了一種適用于量熱式農藥快速檢測的生物敏感元件及其制作方法，其特點是該生物敏感元件由從動植物體中提取的B－酯酶和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1)酶液的提取；2)酶的部分純化；3)酶的固定化。由本方法制作的生物敏感元件利用酶聯級反應大大提高了量熱式農藥檢測的靈敏度，適用于量熱式農藥快速檢測。
文檔編號G01N33/48GK1987439SQ20061014724
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者徐斐, 姜覓, 胥義, 華澤釗, 馬天畫 申請人:上海理工大學