一種木聚糖酶的固定化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酶的固定化方法，尤其涉及一種木聚糖酶的固定化方法。
【背景技術】
[0002]木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復雜酶系，組成比較復雜，是木聚糖水解酶系中最關鍵的水解酶，通過水解木糖分子β -1, 4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖和木二糖等低木聚糖以及少量木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶包括內切β_1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、a-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等。木聚糖酶在自然界中分布相當廣泛，在海洋及陸地細菌、海洋藻類、真菌等中存在，已報道的能產木聚糖酶的微生物有細菌、鏈霉菌、曲霉和青霉等，目前使用的木聚糖酶主要是利用米曲酶、黑曲酶、芽孢桿菌和酵母菌等發酵后，經提取、濃縮等工藝加工而成。但是游離的木聚糖酶穩定性差，保質期短，重復利用率低，應用成本高，因此木聚糖酶的廣泛應用受到限制。
[0003]酶的固定化是通過物理或者化學的方法，將酶分子束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便于與反應液分離，可以反復使用。固定化酶具有較高的酶活性、穩定性高，可反復使用，耐一定強度的酸、堿、熱及有機溶劑。作為固定化酶的一部分，固定化酶的載體材料對固定化酶的各種性能都有著巨大的影響，殼聚糖因其分子中存在豐富的羥基和氨基使其易于進行化學反應而賦予獨特性能，特別是豐富的氨基與各種蛋白質的親和力非常高，是一種良好的酶固定化載體，并且不存在殘存單體，使得其作為載體較其他高聚物有更大的優越性，但是現有技術中以殼聚糖為載體并配合交聯劑及選擇合適的固定化酶制備工藝，雖然固定化木聚糖酶的轉化率、活力回收率均有所提高，但是固定化酶的力學性能、穩定性差，并且現有技術中沒有涉及細菌纖維素/殼聚糖復合微球為載體來實現酶的固定化的技術。
【發明內容】
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[0004]針對上述現有技術中的存在的問題，本發明提供一種新型復合固定化酶載體，以細菌纖維素/殼聚糖復合微球為載體，通過交聯劑交聯木聚糖酶與細菌纖維素/殼聚糖復合微球，增強復合凝膠的機械強度、親水性和穩定性。
[0005]為達到上述目的，本發明通過如下技術方案來實現:
[0006]—種木聚糖酶的固定化方法，以細菌纖維素/殼聚糖復合微球為固定化載體，包括固定化載體的制備和固定化木聚糖酶的制備，其中固定化載體的制備包括種子培養、細菌纖維素的制備、細菌纖維素的打漿和細菌纖維素/殼聚糖復合微球的制備。
[0007]進一步，固定化載體的制備通過以下步驟實現:
[0008](I)種子培養:取活化的木醋桿菌CGMCC N0.1.1812斜面種子，接入在HS培養基中，在30°C下，轉速為160r/min，振蕩培養24h ；
[0009](2)細菌纖維素的制備:細菌纖維素為膜式細菌纖維素或絮狀細菌纖維素，當細菌纖維素為膜式細菌纖維素，則制備方法為:以2?10%的接種量接入HS發酵培養基中，30°C下培養2?6d，形成細菌纖維素凝膠，用0.lmol/1的NaOH溶液煮沸處理6h，用蒸餾水清洗至細菌纖維素凝膠的PH為7.0，將該細菌纖維素凝膠在105°C下干燥至恒重，得到細菌纖維素干膜；當細菌纖維素為絮狀細菌纖維素，則制備方法為:以2?10%的接種量接入HS發酵培養基中，30°C下培養2?6d，形成細菌纖維素凝膠；
[0010](3)細菌纖維素的打漿:當細菌纖維素為膜式細菌纖維素時，將步驟(2)中制備得到的細菌纖維素干膜與4%醋酸溶液置于打漿機中，細菌纖維素干膜的質量與4%醋酸溶液的體積之比為1:40，轉速為300?1000r/min，時間5?15min，形成混懸液；當細菌纖維素為絮狀細菌纖維素時，將步驟(2)中制備得到的細菌纖維素凝膠浸泡于0.lmol/1的NaOH溶液中，100°C煮沸6h，用蒸餾水或0.1M的醋酸溶液沖洗，至pH值為7.0，將細菌纖維素凝膠與4%醋酸溶液置于打漿機中，其中細菌纖維素濕重與4%醋酸溶液的體積之比為1:4，轉速為300?1000r/min，時間5?15min，形成混懸液；
[0011](4)細菌纖維素/殼聚糖復合微球的制備:稱取2?4g殼聚糖，加入步驟⑶中制備得到的細菌纖維素混懸液25?100ml，充分溶解得殼聚糖-細菌纖維素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應Ih以上，用PH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，離心，真空干燥，備用。
[0012]進一步，固定化木聚糖酶的制備通過以下步驟實現:
[0013](I)稱取細菌纖維素/殼聚糖復合微球I?2g，加入0.5%戊二醛10?20ml，緩慢攪拌30分鐘，室溫下靜置12小時，離心去上清液，用pH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗去多余的戊二醛，留沉淀，離心、真空干燥，得含交聯醛基的細菌纖維素/殼聚糖復合微球；
[0014](2)稱取步驟⑴中得到的含交聯醛基的細菌纖維素/殼聚糖復合微球I?2g，加入10?20ml木聚糖酶溶液，攪拌均勻，4°C下交聯反應12小時，離心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。
[0015]進一步，固定化載體的制備方法中步驟(4)細菌纖維素/殼聚糖復合微球的制備方法為:稱取2?3g殼聚糖，加入步驟(3)中制備得到的細菌纖維素混懸液25?50ml，充分溶解得殼聚糖-細菌纖維素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應6h，用PH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，離心，真空干燥，備用。
[0016]進一步，固定化載體的制備方法中步驟(4)細菌纖維素/殼聚糖復合微球的制備方法為:稱取2g殼聚糖，加入步驟(3)中制備得到的細菌纖維素混懸液25ml，充分溶解得殼聚糖-細菌纖維素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應6h，用PH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，離心，真空干燥，備用。
[0017]進一步，固定化木聚糖酶的制備方法中:步驟(2):稱取步驟(I)中制備得到的含交聯醛基的細菌纖維素/殼聚糖復合微球1.5?2g，加入15?20ml木聚糖酶溶液，攪拌均勻，4°C下交聯反應12小時，離心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。
[0018]進一步，固定化木聚糖酶的制備方法步驟(2)中木聚糖酶的濃度為0.25?2.0mg/ml ο
[0019]本發明還提供一種固定化木聚糖酶，是以細菌纖維素/殼聚糖復合微球為固定化載體，該固定化木聚糖酶是用上述木聚糖酶的固定化方法制備得到。
[0020]本發明的有益效果:
[0021](I)細菌纖維素/殼聚糖微球的制備過程中，不需要采用特殊的添加方法，直接將打漿后的細菌纖維素添加至殼聚糖中，從而提高固定化酶的親水性、穩定性和機械強度。
[0022](2)木聚糖酶經細菌纖維素/殼聚糖微球固定化后，其活力回收率達75.3%，相對酶活力達到80.5%，該固定化酶連續使用5次后，酶活力保持83.6%，具有較好的穩定性，該固定化酶具有較高的應用價值。
【具體實施方式】
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[0023]下面結合具體實施例對本發明的內容進一步說明。
[0024]實施例1
[0025]本實施例的一種木聚糖酶的固定化方法，以細菌纖維素/殼聚糖復合微球為固定化載體，包括固定化載體的制備和固定化木聚糖酶的制備，步驟如下:
[0026](I)固定化載體的制備:
[0027]a.種子培養:將購自中國工業微生物菌種保藏管理中心的木醋桿菌CGMCCN0.1.1812斜面種子接入裝有10ml HS種子培養液中，在30°C下轉速為160rpm下振蕩培養24h，得到種子培養液；
[0028]b.細菌纖維素的制備:以2% (v/v)的接種量接入裝有HS發酵培養基的錐形瓶中，30°C下在培養箱中靜置培養6d，形成細菌纖維素凝膠；
[0029]c.細菌纖維素的打漿:取步驟b中制備的細菌纖維素凝膠浸泡于0.lmol/1的NaOH溶液中，100°C煮沸6h，用蒸餾水沖洗，至pH值為7.0，將細菌纖維素凝膠與4%醋酸溶液置于打漿機中，其中細菌纖維素濕重與4%醋酸溶液的體積之比為1:4，置于打漿機中，轉速為300r/min，處理時間為15min，得到細菌纖維素混懸液；
[0030]d.細菌纖維素/殼聚糖微球的制備:稱取殼聚糖2g，加入步驟c制備的細菌纖維素混懸液50ml，用玻璃棒攪拌混合均勻，制備得到殼聚糖-