專利名稱：用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法
技術領域：
本發明的技術方案涉及生物化學電極，具體地說，是用于檢測農藥殘留的生物酶電 極的制作方法。
背景技術：
近年來，農產品中農藥殘留超標問題已引起人們的廣泛關注。用于檢測農藥殘留的生 物傳感器也得到不斷的研發和利用。
Mulchandani 等 (Flow injection amperometric enzyme biosensor for direct determination of orga叩hosphate nerve agents, Environ. Sci. Technol. 2001， (35)) 結合流動注射技術研制的流動注射安培型有機磷水解酶生物傳感器(FIAB)，通過檢測有 機磷的水解產物對硝基苯酚，來判斷有機磷的濃度。Jeanty等(Detection of paraoxon by continuous flow system based enzyme sensor, Biosensors and Bioelectronics. 1998， (13))用流動注射乙酰膽堿酯酶生物傳感器檢測有機磷農藥對氧磷及其衍生物。魏 福祥等(乙酰膽堿酯酶生物傳感器法測定蔬菜水果中有機磷農藥殘留，食品科學， 2007(28))介紹了一種利用乙酰膽堿酯酶生物傳感器技術測定蔬菜水果中有機磷農藥殘 留。上述方法均為試圖通過酶固定方法和材料的改變來提高生物傳感器的性能，但是存 在有或者線性范圍窄，或者檢測靈敏度不高、或者抗干擾能力不強等缺點，而且皆不能 控制酶量的使用。Haibin Shi等(Electroanalysis, 2005, 17， (14) : 1285-1290)報道了 利用分子一酶層層自組裝累積膜技術在電極上制備導電高分子膜，利用高分子聚合物 PDDA和膽堿氧化酶制備了膽堿傳感器即Pt/(PDDA/Ch0x)n。 Zhao Song等(Sensor & Actuator B, 2006， 115: 626 - 633)報道了以納米碳管修飾鉑電極為基礎電極，采用溶膠 -凝膠法固定膽堿氧化酶(ChOx)，構建了電流型膽堿檢測生物傳感器。CN2723998和宋昭 等人(傳感器技術,2005， 24(7) :16-18)報道了以絲網印刷電極為載體，以明膠包埋為主 要方法制備了基于乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的電流型生物傳感器酶電極。CN 01253887.6披露了一種探測農藥殘留用的量熱式生物傳感器，由被測液處理單元和檢測 單元組成，被測液處理單元包括前處理器、過濾器、樣液容器、緩沖液容器、導管、蠕 動泵、脈沖阻尼器、微量注射泵，檢測單元包括內、外膽組成的恒溫器、半導體制冷器、 三通，檢測酶柱、參考酶柱，溫度檢測元件置于酶柱兩側，檢測酶柱出口液體的溫度差， 輸出和處理、顯示單元及微處理機連接。這種量熱式生物傳感器的組成結構復雜、成本 昂貴、特別是由于實際檢測應用中，被抑制的酶的活性很難逆轉，酶反應層的再次固定 活化會成為首要問題。CN1699985披露了農藥檢測用納米修飾微型電化學生物傳感器的制
法，是由納米復合型酶電極、微型銀/氯化銀(Ag/AgCl)參比電極和對電極組成，具體 結構為納米材料與酶復合，與薄膜狀的工作電極結合，同薄膜狀的微型銀/氯化銀
(Ag/AgCl)參比電極以及薄膜狀的對電極共同組成薄膜狀式三電極型傳感器。它將酶與
納米碳管直接混合滴加在工作電極上，然后對底物進行檢測，難免存在以下缺點(1)
不能很好地控制酶量使用(2)檢測過程易受干擾物的影響，即抗干擾能力不強，(3)酶
固定不夠牢固造成電極穩定性不好，重復性差。
總之，在采用生物傳感器測試農藥殘留的己有方法中，生物傳感器的靈敏度，穩定 性和抗干擾能力仍然有待進一歩提高。因此，研發靈敏度高，穩定性好，抗干擾能力強 的用于殘留農藥檢測的生物酶電極非常必要。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法， 其中采用了將納米顆粒和層層自組裝技術相結合的方法，進一步提高了用于殘留農藥檢 測的生物酶電極的靈敏度、穩定性和抗干擾能力。
本發明解決該技術問題所采用的技術方案是用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制 作方法，采用將納米顆粒和層層自組裝技術相結合的方法，具體歩驟如下
用有機絕緣材料做成棒狀電極載體，在其下端的橫截面上涂制基體導電材料，形成 電極，或者直接購買到該類電極，再在該電極的導電材料的外表面用如下所述工序制作 由納米顆粒層、抗干擾層和靜電吸附酶層構成的反應層，由此制作成用于檢測農藥殘留 的生物酶電極。
第一步，電極下端導電材料外表面的處理
用鋁粉打磨上述電極下端導電材料外表面部分至清潔，然后移入超聲波水浴中清洗 2 3分鐘，重復3次，再用乙醇、稀鹽酸和蒸餾水徹底超聲洗滌使該電極下端導電材料 外表面潔凈如鏡面，晾干后備用；
第二步，用納米顆粒修飾電極形成納米顆粒層
將納米顆粒置于體積比為濃硫酸:濃硝酸=3:1的混酸溶液中，超聲震蕩4小時，分 散成均勻淺黑色溶液，用離心機10000轉/分離心，倒掉上清酸液，再加水超聲分散洗 滌5分鐘，反復多次洗滌至該黑色溶液近中性，制成濃度為lg/L的納米顆粒溶液，置于 4'C冰箱中存放待用，將由第一步處理好的電極下端浸入該納米顆粒溶液中25分鐘，在 其導電材料外表面吸附納米顆粒，形成納米顆粒層，然后將該電極置于緩沖液中清洗5 分鐘，洗去吸附不牢的納米顆粒，由此完成納米顆粒修飾電極的工序-，
第三步，層層自組裝制備抗干擾層
將第二歩用納米顆粒修飾的電極的下端浸入到濃度為2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞 胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中至少一種的陽離子高分子聚合物溶液中25分鐘，取出該 電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/rnL的聚磺化乙烯、聚磺 化苯乙烯中至少一種的陰離子高分子聚合物溶液中25分鐘，重復這個過程直至交替鍍上
1 3層高分子聚合物累積膜，完成抗干擾層的制備； 第四歩，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a. 層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米顆粒的濃度為2mg/mL 的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中的至少一種的陽離子高分子聚合 物溶液中25分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為 2mg/mL的膽堿氧化酶溶液中25分鐘，重復這個過程直至交替鍍上2 15層高分子聚合 物與酶的復合膜，完成膽堿氧化酶酶層的制備，由此制得檢測膽堿的膽堿生物酶電極；
b. 層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四步a完成膽堿氧化酶酶層制備的電極的下端浸入到混有5%納米顆粒的濃度為 2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中的至少一種的陽離子高分 子聚合物溶液中25分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃 度為2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中25分鐘，重復這個過程直至交替鍍上1 5層高分子 聚合物與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層的制備，也完成了反應層的制作，并最終 制得用于檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生物酶電極；
上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，所用溶液的濃度均為重量/體積 百分比濃度，所用的緩沖液的配制方法是將NaOH 1. 874克、KH2P(X 6. 805克，定容于lOOOmL 的容量瓶中，pH8.0。
上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，所述用作電極的基體導電材料 是金、碳、鉑或銀。
上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，所述用有機絕緣材料做成的棒 狀電極載體，其棒狀的橫截面是方形、長方形、圓形、橢圓形或其他圖形。
上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，所述納米顆粒為納米碳管或納 米金，其顆粒大小范圍在8 100nm。納米碳管或納米金是購買到的公知原料物品。
上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，生物酶電極所選用的有機絕緣 材料是本領域技術人員熟知的。
上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，在有機絕緣材料載體上涂制導 電材料的方法是本領域技術人員熟知的。 本發明的有益效果是
(1) 本發明方法制作的用于檢測農藥殘留的生物酶電極對乙酰膽堿的檢測線性范 圍5X 10—6 8X 10—4mol/L，檢出限為5X 10—6mol/L;對敵百蟲的檢測線性范圍為0. 01 0. 6 pg/mL，檢出極限為1 X 10—w mol/L。
(2) 在上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，第四歩a完成制作的膽 堿生物酶電極，對膽堿的檢測線性范圍5X 10—7 1 X 10—4 mol/L;靈敏度12. 53nA/mmol; 檢測時間可控制在7.6秒，檢出限為2Xl(Tmol/L。其總體性能優于先前報道的膽堿生 物酶電極。
(3) 本發明方法制作的用于檢測農藥殘留的生物酶電極，修飾有納米顆粒。由于納 米顆粒增效效應，該傳感器的響應靈敏度明顯提高，比未修飾納米顆粒的高出20%左右。
(4) 本發明方法制作的用于檢測農藥殘留的生物酶電極使用了高分子聚合物多層膜 作為抗干擾層，使得用該生物酶電極組裝的整個生物傳感器具有抗干擾能力強的特點， 干擾物的影響幾乎可以忽略。
(5) 由于本發明用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，采用了將納米顆粒 和層層累積自組裝技術相結合的方法，既提高了用該生物酶電極組裝的生物傳感器的靈 敏度，又能很好的控制酶量的使用。層層累積自組裝是指分子與分子在一定條件下，利 用分子識別，依賴分子間作用力自發連接成結構穩定的分子聚集體的過程。
本發明的有益效果具體反映在實施例U 12及圖3 12中。
總之，本發明用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法，方法簡單，用該生物酶 電極構成的生物傳感器靈敏度高，性能穩定，抗干擾能力強，適用于檢測農藥殘留的生 物傳感器產業化的實際應用。
下面結合附圖和實施例對本發明進一歩說明。 圖1本發明棒狀檢測農藥殘留的生物酶電極的縱剖面示意圖。 圖2本發明檢測農藥殘留的生物酶電極的下端導電材料及其外表面的反應層構成的 示意圖。
圖3納米碳管修飾電極(a)與裸鉑電極(b)對lmmo1/ L過氧化氫的電流響應。
圖4不同層數膽堿氧化酶復合薄膜修飾膽堿生物傳感器的循環伏安曲線。
圖5膽堿氧化酶復合薄膜的層數對傳感器響應電流的影響。
圖6膽堿氧化酶復合薄膜修飾傳感器對氯化膽堿響應的工作曲線。
圖7膽堿氧化酶復合薄膜修飾傳感器對氯化膽堿響應的電流-時間曲線。
圖8干擾物對Pt/MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8膽堿傳感器響應電流的影響，
該圖中，a.膽堿，b.抗壞血酸，c.醋氨酚，d.尿酸，e.膽堿。 圖9 Pt/MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8膽堿傳感器的穩定性研究。 圖10乙酰膽堿酯酶復合薄膜的層數對傳感器響應電流的影響。 圖11 Pt/ MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8+(PDDA/AChE)2復合薄膜修飾電極對
乙酰膽堿響應的電流-時間曲線。
圖12農藥殘留傳感器Pt/MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8+(PDDA/AChE)2對敵
百蟲的響應。
圖中，l.用有機絕緣材料做成的棒狀電極載體，2.在有機絕緣材料做成棒狀電極載 體下端的橫截面上涂制的導電材料金、碳、鉑或銀及導電材料外表面的反應層，3.導電 材料金、碳、鉑或銀，4.納米顆粒層，5.抗干擾層，6.膽堿氧化酶酶層，7.乙酰膽 堿酯酶酶層。
具體實施例方式
實施例1
用有機絕緣材料做成橫截面為方形的棒狀電極載體(1)，在其下端的橫截面上涂制 金(3)，制作成如圖l所示的棒狀工作電極。 實施例2
除用碳替換金，橫截面為長方形之外，其他同實施例l。 實施例3
除用鉑替換金，橫截面為圓形之外，其他同實施例l。 實施例4
除用銀替換金，橫截面為橢圓形之外，其他同實施例l。 實施例5
第一歩，電極下端導電材料外表面的處理
用鋁粉打磨由實施例1制得的電極下端涂制的金(3)的外表面部分至清潔，然后移 入超聲波水浴中清洗2 3分鐘，重復3次，再用乙醇、稀酸和蒸餾水徹底超聲洗滌使 工作電極的下端導電材料外表面潔凈如鏡面，晾干后備用；
第二歩，用納米碳管修飾工作電極形成納米顆粒層
將顆粒大小范圍在8 100nm的納米碳管置于體積比為濃硫酸:濃硝酸二3:l的混酸 溶液中，超聲震蕩4小時分散成均勻淺黑色溶液，用離心機10000轉/分離心，倒掉上 清酸液，再加水超聲分散洗滌5分鐘，反復多次洗滌至該黑色溶液近中性，制成濃度為 lg/L的納米碳管溶液，置于4。C冰箱中存放待用，將由第一歩處理好的電極的下端浸入 該納米碳管溶液中25分鐘，在其導電材料外表面吸附納米碳管，然后將該電極置于緩沖 液中清洗5分鐘，洗去吸附不牢的納米碳管，形成納米顆粒層(4)，由此完成納米碳管 修飾工作電極的工序；
第三步，層層自組裝制備抗干擾層
將第二步用納米碳管修飾的電極的下端浸入到濃度為2mg/mL的聚丙烯胺陽離子高 分子聚合物溶液中25分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到 濃度為2mg/mL的聚磺化乙烯陰離子高分子聚合物溶液中25分鐘，重復這個過程直至交 替鍍上1層高分子聚合物累積膜，完成抗干擾層(5)的制備；
第四步，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a. 層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三歩完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度為2mg/mL 的聚丙烯胺陽離子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再 取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的膽堿氧化酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交 替鍍上2層高分子聚合物與酶的復合膜，完成膽堿氧化酶酶層(6)的制備，由此制得檢 測膽堿的膽堿生物酶電極；
b. 層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四步a完成膽堿氧化酶酶層的制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度 為2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中的至少一種的陽離子 高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入 到濃度為2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上1層高分 子聚合物與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層(7)的制備，也完成了如圖2所示反應 層(2)的制作，并最終制得檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生物酶電極。 實施例6
第一歩，電極下端導電材料外表面的處理
用鋁粉打磨由實施例2制得的電極下端涂制的碳(3)的外表面部分至清潔，然后移 入超聲波水浴中清洗2 3分鐘，重復3次，再用乙醇、稀酸和蒸餾水徹底超聲洗滌使 電極的下端導電材料外表面潔凈如鏡面，晾干后備用；
第二歩，用納米金修飾電極形成納米顆粒層
將顆粒大小范圍在8 100nm的納米金置于體積比為濃硫酸:濃硝酸=3:1的混酸溶 液中，超聲震蕩4小時分散成均勻淺黑色溶液，10000轉/分離心，倒掉上清酸液，再 加水超聲分散洗滌5分鐘，反復多次洗滌至該黑色溶液近中性，制成濃度為lg/L的納米 金溶液，置于4'C冰箱中存放待用，將由第一步處理好的電極的下端浸入該納米金溶液 中25分鐘，在其導電材料外表面吸附納米金，然后將該電極置于緩沖液中清洗5分鐘， 洗去吸附不牢的納米金，形成納米顆粒層(4)，由此完成納米金修飾電極的工序；
第三歩，層層自組裝制備抗干擾層
將第二歩用納米金修飾的電極的下端浸入到濃度為2mg/mL的聚乙烯亞胺陽離子高 分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到 濃度為2mg/mL的聚磺化苯乙烯陰離子高分子聚合物溶液中20分鐘，重復這個過程直至 交替鍍上2層高分子聚合物累積膜，完成抗干擾層(5)的制備；
第四步，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a. 層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米金的濃度為2mg/mL的 聚乙烯亞胺陽離子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再 取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的膽堿氧化酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交 替鍍上6層高分子聚合物與酶的復合膜，完成膽堿氧化酶酶層(6)的制備，由此制得檢 測膽堿的膽堿生物酶電極；
b. 層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四步a完成膽堿氧化酶酶層的制備的電極的下端浸入到混有5。/。納米金的濃度為 2mg/mL的聚乙烯亞胺陽離子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中 5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中20分鐘，重復這 個過程直至交替鍍上2層高分子聚合物與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層(7)的制 備，也完成了如圖2所示反應層(2)的制作，并最終制得檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生
物酶電極。 實施例7
第一步，電極下端導電材料外表面的處理
用鋁粉打磨由實施例3制得的電極下端涂制的鉑(3)的外表面部分至清潔，然后移 入超聲波水浴中清洗2 3分鐘，重復3次，再用乙醇、稀酸和蒸餾水徹底超聲洗滌使 電極的下端導電材料外表面潔凈如鏡面，晾干后備用；
第二步，用納米碳管修飾電極形成納米顆粒層
將顆粒大小范圍在8 100nm的納米碳管置于體積比為濃硫酸濃硝酸二3:1的混酸 溶液中，超聲震蕩4小時分散成均勻淺黑色溶液，10000轉/分離心，倒掉上清酸液， 再加水超聲分散洗滌5分鐘，反復多次洗滌至該黑色溶液近中性，制成濃度為lg/L的納 米碳管溶液，置于4'C冰箱中存放待用，將由第一歩處理好的電極的下端浸入該納米碳 管溶液中25分鐘，在其導電材料外表面吸附納米碳管，然后將該電極置于緩沖液中清洗 5分鐘，洗去吸附不牢的納米碳管，形成納米顆粒層(4)，由此完成納米碳管修飾電極 的工序；
第三步，層層自組裝制備抗干擾層
將第二歩用納米碳管修飾的電極的下端浸入到濃度為2mg/mL的聚二烯丙基二甲基 氯化銨陽離子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出 該電極再浸入到濃度為2mg/mL的聚磺化乙烯與聚磺化苯乙烯以任意比例混合的陰離子 高分子聚合物溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上3層高分子聚合物累積膜，完 成抗干擾層(5)的制備；
第四步，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a. 層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度為2mg/mL 的聚二烯丙基二甲基氯化銨高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5 分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的膽堿氧化酶溶液中20分鐘，重復這個過 程直至交替鍍上8層高分子聚合物與酶的復合膜，完成膽堿氧化酶酶層(6)的制備，由 此制得檢測膽堿的膽堿生物酶電極；
b. 層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四步3完成膽堿氧化酶酶層的制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度
為2mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化銨陽離子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極 再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中 20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上3層高分子聚合物與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯 酶酶層(7)的制備，也完成了如圖2所示反應層(2)的制作，并最終制得檢測乙酰膽 堿和農藥殘留的生物酶電極。 實施例8
第一歩，電極下端導電材料外表面的處理
用鋁粉打磨由實施例4制得的電極下端涂制的銀(3)的外表面部分至清潔，然后移 入超聲波水浴中清洗2 3分鐘，重復3次，再用乙醇、稀酸和蒸餾水徹底超聲洗滌使 電極的下端導電材料外表面潔凈如鏡面，晾干后備用；
第二步，用納米碳管修飾電極形成納米顆粒層
將顆粒大小范圍在8 100皿的納米碳管置于體積比為濃硫酸:濃硝酸=3:1的混酸 溶液中，超聲震蕩4小時分散成均勻淺黑色溶液，10000轉/分離心，倒掉上清酸液， 再加水超聲分散洗滌5分鐘，反復多次洗滌至該黑色溶液近中性，制成濃度為lg/L的納 米碳管溶液，置于4'C冰箱中存放待用，將由第一歩處理好的電極的下端浸入該納米碳 管溶液中25分鐘，在其導電材料外表面吸附納米碳管，然后將該電極置于緩沖液中清洗 5分鐘，洗去吸附不牢的納米碳管，形成納米顆粒層(4)，由此完成納米碳管修飾電極 的工序；
第三步，層層自組裝制備抗干擾層 同實施例7;
第四步，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a. 層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度為2mg/mL 的聚丙烯胺與聚乙烯亞胺以任意比例混合的陽離子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該 電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的膽堿氧化酶溶液 中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上10層高分子聚合物與酶的復合膜，完成膽堿氧 化酶酶層(6)的制備，由此制得檢測膽堿的膽堿生物酶電極；
b. 層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四步a完成膽堿氧化酶酶層的制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度 為2mg/mL的聚丙烯胺與聚二烯丙基二甲基氯化銨以任意比例混合的陽離子高分子聚合 物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為 2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上4層高分子聚合物 與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層(7)的制備，也完成了如圖2所示反應層(2) 的制作，并最終制得檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生物酶電極。 實施例9
第一步，電極下端導電材料外表面的處理 同實施例7;
第二步，用納米碳管修飾電極形成納米顆粒層 同實施例7;
第三歩，層層自組裝制備抗干擾層
同實施例7;
第四步，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a.層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度為2mg/mL 的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺與聚二烯丙基二甲基氯化銨以任意比例混合的陽離子高分子聚 合物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為 2mg/mL的膽堿氧化酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上12層高分子聚合物 與酶的復合膜，完成膽堿氧化酶酶層(6)的制備，由此制得檢測膽堿的膽堿生物酶電極；
b.層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四步a完成膽堿氧化酶酶層的制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度 為2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺與聚二烯丙基二甲基氯化銨以任意比例混合的陽離 子高分子聚合物溶液中20分鐘，取出該電極冉浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸 入到濃度為2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上5層高 分子聚合物與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層(7)的制備，也完成了如圖2所示反 應層(2)的制作，并最終制得檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生物酶電極。 實施例10
第一步，電極下端導電材料外表面的處理 同實施例7;
第二步，用納米碳管修飾電極 同實施例7;
第三步，層層自組裝制備抗干擾層 同實施例7;
第四歩，層層自組裝制備靜電吸附酶層
a. 層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層
將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度為2mg/mL 的聚丙烯胺與聚二烯丙基二甲基氯化銨以任意比例混合的陽離子高分子聚合物溶液中 20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的 膽堿氧化酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上15層高分子聚合物與酶的復合 膜，完成膽堿氧化酶酶層(6)的制備，由此制得檢測膽堿的膽堿生物酶電極；
b. 層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層
將第四歩a完成膽堿氧化酶酶層的制備的電極的下端浸入到混有5%納米碳管的濃度 為2mg/mL的聚丙烯胺與聚二烯丙基二甲基氯化銨以任意比例混合的陽離子高分子聚合 物溶液中20分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為 2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中20分鐘，重復這個過程直至交替鍍上1層高分子聚合物 與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層(7)的制備，也完成了如圖2所示反應層(2) 的制作，并最終制得檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生物酶電極。
上述實施例5 10中，所用溶液的濃度均為重量/體積百分比濃度，所用的緩沖液的 配方是將NaOH 1.874克、KH2P04 6. 805克，定容于1000mL的容量瓶中，pH8.0。
實施例11
將上述實施例7第四歩a中制得的膽堿生物酶電極作作為工作電極，與對電極(鉑 絲)和參比電極(Ag/AgCl)—起構成檢測膽堿的三電極系統的生物傳感器，其組裝方法是 本領域技術人員所熟知的。以20mL 0. 10mol/L的磷酸鹽緩沖液為電解質，在+0. 6V下 測定該生物傳感器對膽堿的響應電流，該測定方法和過程是本領域技術人員所熟知的， 測定結果見圖3 9。由此可見，用本發明制作方法制得的膽堿生物酶電極對膽堿的檢測 線性范圍5X10—7 lX104mol/L;靈敏度12. 53nA/mmol;檢測時間可控制在7. 6秒， 檢出限為2X10—7mol/L。 實施例12
將上述實施例7中制得的用于檢測農藥殘留的生物酶電極作為工作電極，與對電極 (鉑絲)和參比電極(Ag/AgCl)—起構成檢測農藥殘留的三電極系統的生物傳感器，其組 裝方法和測定方法同實施例11，測定結果見圖10 12。該生物酶電極對乙酰膽堿的檢測 線性范圍5X10—6 8X10—4mol/L，檢出限5 X l(T6 mol/L;對敵百蟲的檢測線性范圍為 0. 01 0. 6pg/mL，檢出限為1X10—"'mol/L，用本發明制作方法制得的檢測農藥殘留的生 物酶電極可實現對敵百蟲的快速在線檢測，檢測時間可控制在8分鐘。
權利要求
1.用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法，其特征在于采用將納米顆粒和層層自組裝技術相結合的方法，具體步驟如下用有機絕緣材料做成棒狀電極載體，在其下端的橫截面上涂制基體導電材料，形成電極，或者直接購買到該類電極，再在該電極的導電材料的外表面用如下所述工序制作由納米顆粒層、抗干擾層和靜電吸附酶層構成的反應層，由此制作成用于檢測農藥殘留的生物酶電極，第一步，電極下端導電材料外表面的處理用鋁粉打磨上述電極下端導電材料外表面部分至清潔，然后移入超聲波水浴中清洗2～3分鐘，重復3次，再用乙醇、稀鹽酸和蒸餾水徹底超聲洗滌使該電極下端導電材料外表面潔凈如鏡面，晾干后備用；第二步，用納米顆粒修飾電極形成納米顆粒層將納米顆粒置于體積比為濃硫酸∶濃硝酸＝3∶1的混酸溶液中，超聲震蕩4小時，分散成均勻淺黑色溶液，用離心機10000轉/分離心，倒掉上清酸液，再加水超聲分散洗滌5分鐘，反復多次洗滌至該黑色溶液近中性，制成濃度為1g/L的納米顆粒溶液，置于4℃冰箱中存放待用，將由第一步處理好的電極下端浸入該納米顆粒溶液中25分鐘，在其導電材料外表面吸附納米顆粒，形成納米顆粒層，然后將該電極置于緩沖液中清洗5分鐘，洗去吸附不牢的納米顆粒，由此完成納米顆粒修飾電極的工序；第三步，層層自組裝制備抗干擾層將第二步用納米顆粒修飾的電極的下端浸入到濃度為2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中至少一種的陽離子高分子聚合物溶液中25分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一種的陰離子高分子聚合物溶液中25分鐘，重復這個過程直至交替鍍上1～3層高分子聚合物累積膜，完成抗干擾層的制備；第四步，層層自組裝制備靜電吸附酶層a.層層自組裝制備膽堿氧化酶酶層將第三步完成抗干擾層制備的電極的下端浸入到混有5％納米顆粒的濃度為2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中的至少一種的陽離子高分子聚合物溶液中25分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的膽堿氧化酶溶液中25分鐘，重復這個過程直至交替鍍上2～15層高分子聚合物與酶的復合膜，完成膽堿氧化酶酶層的制備，由此制得檢測膽堿的膽堿生物酶電極；b.層層自組裝制備乙酰膽堿酯酶酶層將第四步a完成膽堿氧化酶酶層制備的電極的下端浸入到混有5％納米顆粒的濃度為2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨中的至少一種的陽離子高分子聚合物溶液中25分鐘，取出該電極再浸入緩沖液中5分鐘，再取出該電極再浸入到濃度為2mg/mL的乙酰膽堿酯酶溶液中25分鐘，重復這個過程直至交替鍍上1～5層高分子聚合物與酶的復合膜，完成乙酰膽堿酯酶酶層的制備，也完成了反應層的制作，并最終制得用于檢測乙酰膽堿和農藥殘留的生物酶電極；上述用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法中，所用溶液的濃度均為重量/體積百分比濃度，所用的緩沖液的配制方法是將NaOH 1.874克、KH2PO4 6.805克，定容于1000mL的容量瓶中，pH8.0。
2. 根據權利要求1所述檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法，其特征在于所述 用作電極的基體導電材料是金、碳、鉑或銀。
3. 根據權利要求1所述檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法，其特征在于所述 用有機絕緣材料做成的棒狀電極載體，其棒狀的橫截面是方形、長方形、圓形、橢圓形 或其他圖形。
4. 根據權利要求1所述檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法，其特征在于所述 納米顆粒為納米碳管或納米金，其顆粒大小范圍在8 100nm。
全文摘要
本發明用于檢測農藥殘留的生物酶電極的制作方法屬于生物化學電極，該制作方法采用將納米顆粒和層層自組裝技術相結合的方法，步驟是用有機絕緣材料做成棒狀電極載體，在其下端的橫截面上涂制基體導電材料，形成電極、或者直接購買到該類電極，再在該電極的導電材料的外表面，用納米顆粒修飾電極形成納米顆粒層，層層自組裝制備抗干擾層，層層自組裝制備靜電吸附酶層，得到由納米顆粒層、抗干擾層和靜電吸附酶層構成的反應層，并由此制作成用于檢測農藥殘留的生物酶電極。本發明制作方法簡單，用該方法制作的生物酶電極組裝的生物傳感器靈敏度高，性能穩定，抗干擾能力強，適用于檢測農藥殘留的生物傳感器產業化的實際應用。
文檔編號G01N27/327GK101178375SQ20071015084
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月10日 優先權日2007年12月10日
發明者楊星群, 新 王, 王新勝, 王艷艷, 霞 秦, 趙紫霞, 強 陳, 馬維一 申請人:楊星群;馬維一;陳 強