專利名稱：定量檢測動物源性食品中新霉素b含量試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于免疫分析技術領域，尤其是一種定量檢測動物源性食品中 新霉素B含量試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
新霉素屬于氨基糖苷類藥物，由鏈霉菌產生，可分離出A、 B、 C三種 主要成分，新霉素B是主要成分；A和C的活性比B低，但B的抗菌作用 比C強2 4倍，因此新霉素B是新霉素殘留的標識物。新霉素抗菌譜廣， 對革蘭氏陽性菌和結核桿菌均有良好的抑制作用。在獸醫臨床上，新霉素 主要用于治療畜禽細菌性腸炎，另外，新霉素還被廣泛用于治療畜禽乳腺 炎、角膜炎、結膜炎、耳炎、皮炎、外傷感染以及足腐爛等疾病；在畜禽 養殖上，新霉素可提高飼料利用率，促進畜禽生長。新霉素因其抗菌活力 強、作用范圍廣泛、用量少、價格低、口服安全性能高等優點而作為一種 常用獸藥及具有發展前景的詞料添加藥物在畜牧業生產中廣為使用。但是 其吸收毒性強，有較大的耳毒性、腎毒性，并可通過藥物破壞溶酶體而引 起磷脂尿、腎小管細胞壞死和急性小管壞死引起的蛋白尿、管型尿，抗生 素后效應較強，其強度與藥物濃度成正比，具有藥物依賴效應。所以新霉 素在動物性食品中的殘留對消費者產生較大的潛在危害，對食品衛生和公 共健康產生了威脅。
伴隨著新霉素在獸醫臨床的大量使用，特別是在飼料中大量添加所導致 的動物性食品中新霉素殘留量增加，誘發繼發性耐藥性問題倍受關注。日本 要求調整動物產品中抗生素新霉素的最大殘留限量，分別為肝臟、肌肉、脂 肪500pg/kg，腎臟10000pg/kg，牛奶500pg/kg和雞蛋暫定標準是500昭/kg。 歐盟對新霉素建立了最大殘留檢測限，規定肝臟、肌肉、脂肪500pg/kg，腎 臟5000jxg/kg，牛奶1500嗎/kg和雞蛋500嗎/kg。我國農業部235號公告規定 的新霉素最高殘留限量為肌肉、脂肪、肝500 pg/kg，腎臟10000(ig/kg，牛 奶500 pg/kg和雞蛋500嗎/kg。
目前新霉素B的測定方法有多種，如薄層層析法(TLC)、微生物法、 比色法和高效液相色譜法(HPLC)等方法。其中，國內外研究與應用較多 的是HPLC法，但是這種方法前處理過程繁瑣，操作復雜，而且通常需要 專業人員進行操作，儀器設備昂貴，檢測過程耗時且費用較高，不適于大
量樣品的現場快速檢測。酶聯免疫吸附劑測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,簡寫ELISA)由于其特異性強，靈敏度高，準確性 好，操作簡便，適于大批量樣品的檢測等優點越來越受到人們的青睞。雖 然很多科研機構和大專院校的科研人員對新霉素B酶聯免疫分析檢測方法 進行了研究，但是檢測的靈敏度和試劑盒的穩定性方面離實際應用還有一 定的距離。
酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)的基本原理是將酶與抗原或抗體用 交聯劑結合起來，此種酶標記抗原或抗體與待測樣品中相應抗體或抗原發 生特異反應，并牢固結合，在加入相應的酶的底物時，底物被酶催化生成 呈色產物，可根據呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技 術是建立在抗原抗體反應和酶的高效催化作用的基礎上，故而該技術具有 檢測靈敏度高、特異性強、準確性好等特點。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種操作簡單、檢測靈 敏度高、特異性強、準確性好、檢測成本低且采用酶聯免疫檢測技術定量 檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒及其檢測方法。
本發明是通過以下技術方案來實現的
一種定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒，由試劑組和包被
板構成，其中試劑組的組成為
(1) .緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH7.3 7.5，使用時用二次水按1:5稀
釋；
(2) .底物A:為含過氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；
(3) .底物B:為含3,3',5,5'-四甲基對二氨基聯苯的二甲基亞砜溶液； (4X洗滌液為含2.5%吐溫的磷酸鹽緩沖液，使用時用二次水按照1:5
稀釋；
(5) .終止液為1.25 mol/L硫酸；
(6) .凍干液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調節pH7.3 7.5，加入蔗糖、 乳糖、牛血清蛋白及抗壞血酸；
(7) .新霉素B標準液其新霉素B標準溶液濃度為10mg/L，使用時用 磷酸鹽緩沖液稀釋至100 pg/L后，再按1:5稀釋六個梯度；
(8) .酶標記新霉素B抗原溶液為新霉素B-辣根過氧化物酶的連接物 新霉素B-HRP，使用時用緩沖液按照1:10萬倍稀釋；
(9) .基質掩蔽劑0.5 %BSA/PBS溶液，且其pH9.0 9.5; 包被板的構成為
包被板為96孔或48孔微孔板并在微孔中包被新霉素B多克隆抗體，
采用Na2C03 — NaHC03的緩沖液將多克隆新霉素B抗體稀釋為包被液， 向包被板中每孔各加入包被液，室溫放置過夜或者35 40 'C恒溫溫育2 3小時，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干液封閉0.8 1.2小時，洗 滌液洗滌四次后，凍干，3 5'C保存。
而且，所述的新霉素B多克隆抗體是選用雄性日本大耳白兔進行六次 免疫，三次免疫后IO天由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進行效 價檢測，末次免疫后采用股動脈采血法對動物采全血，經離心處理后收集 全部血清，采取免疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加0.in/。(W/V) 的疊氮鈉后于4'C儲存備用。
一種定量撿測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒的檢測方法，其 檢測方法的步驟是
(1) .用3 5。C低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液；
(2) .打開試劑盒取出包被板，分別將各種濃度的新霉素B標準液和樣品 提取液加入到包被板各自的微孔中，要雙孔平行加樣，然后再在各種濃度新 霉素B標準液和樣品提取液各自的微孔中分別加入酶標記新霉素B抗原溶 液，震蕩混勻5 10min,室溫反應1 2小時；
(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內液體鬼掉，用吸水紙扣干，加入 底物A和底物B的混合液，室溫下反應0.4 0.6小時;
(4) .向各微孔中加入終止液以終止反應，用酶標儀讀取吸光度值，根據 不同濃度新霉素B標準液的吸光度值繪制新霉素B的標準曲線圖，對照新 霉素B的標準曲線圖得到樣品提取液中新霉素B的含量。
而且，所述的酶標記新霉素B抗原溶液的制備方法是-
(1) .將辣根過氧化物酶HRP用磷酸鹽緩沖液PBS溶解，再將此酶溶 液逐滴加入到新霉素B中，形成混合液；
(2) .將1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶于雙蒸水中，逐滴加 入到新霉素b和酶的混合液中，室溫攪拌反應0.8 1.2小時，然后放于3 5'C連續攪拌過夜，形成反應液；
(3) .將反應液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析90 100小時；
(4) .精確量取酶偶聯物溶液的體積并測定濃度，加入硫柳汞后3 5 °C 保存。
而且，所述的底物A和底物B的混合液的配比為14.6: 0.45。 而且，所述的樣品前處理為將樣品攪碎成均質，放于-2(TC儲存備用， 取樣品加入萃取液，低溫離心，取部分上清液用基質掩蔽劑稀釋。 而且，所述的萃取液為磷酸緩沖液PBS，其pH8 9。 本發明的有益效果和優點是
1. 本發明的試劑盒具有操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強、準確性好、 檢測成本低等特點，而且適用范圍較廣，主要適用于動物源性食品中新霉
素B含量的定量檢測，其抗體具有良好的廣譜性和靈敏度，所得抗體和酶 標抗原穩定，具有常溫保藏時間長的優點。
2. 本發明的快速檢測方法操作簡便、快速，完成全部檢測操作過程只需 幾小時，檢測的精確度可達90%以上，檢測靈敏度可以達到pg/kg級非常適 合現場檢測的需要。由于抗體和酶標抗原在常溫下可以保藏l周，抗體包 被的酶標板在4 'C下可以保藏6個月以上，從而為進行大規模樣品的集中 檢測，提供了極大的方便。
3. 本發明成本低廉、檢測效率高、操作簡便，既有經濟效益又有社會效 益，是一種創新性較高的具有良好的應用前景的定量檢測動物源性食品中 新霉素B含量試劑盒及其檢測方法。
圖1本發明新霉素B-直接競爭ELISA標準曲線圖。
具體實施例方式
本發明通過以下實施例進一步詳述，下述實施例是說明性的，不是限 定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
一種定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒的制備包括以下
步驟
(1) .制備新霉素B-KLH抗原；
(2) .制備新霉素B多克隆抗體；
(3) .制備酶標記新霉素B抗原溶液；
(4) .制備包被板；
(5) .配制試劑組。
其中-
(1).新霉素B-KLH抗原的制備
稱取10mg大分子蛋白匙孔血蘭蛋白(KLH)(以下簡稱KLH)， 用1 mLO.Ol mol/L磷酸鹽緩沖液PBS (緩沖液，以下簡稱PBS) pH 7.4 溶解，取46.7mg新霉素B溶于該蛋白溶液中，再取400mgEDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)溶于雙蒸水中，逐滴加入到新霉素B 和蛋白的混合溶液中，室溫攪拌反應2小時，然后放于3 5'C連續攪拌 過夜，最后將反應液裝入透析袋，在PBS中透析72小時，然后精確量 取蛋白質偶聯物溶液的體積并測定濃度，加入疊氮鈉后4 "C保存。新霉素 B是一種小分子半抗原，只有反應原性而無免疫原性，需要與載體蛋白偶 聯后才能使動物產生免疫應答，本發明以合成的新霉素B-KLH作為免疫
原進行動物免疫。
(2) .新霉素B多克隆抗體的制備
免疫動物選擇日本大耳白兔3只，月齡3個月，體重1.5公斤左右，分 別編號為1號、2號和3號。免疫采取皮下和肌肉注射法共同進行。
免疫程序初次免疫為提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐劑乳
化的免疫原，劑量為1 mg，溶于1 mL 0.9%的NaCl，再與1 mL的弗氏完 全佐劑混合進行乳化。加強免疫初次免疫后第14天進行加強免疫，劑量 為0.5 mg，溶于1 mL 0.9%的NaCl，再與1 mL的弗氏不完全佐劑混合進行 乳化。以后每隔30天加強免疫一次，共免疫6次。從第2次加強免疫開始， 每次免疫IO天后對動物試采血進行血清效價測定和親和力測定。末次免疫 后采用頸動脈采血法對動物采全血，經離心處理后收集全部血清，采取免 疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加0.1%(w/v)的疊氮鈉后于4 °C 儲存備用。
(3) .酶標記新霉素B抗原溶液的制備
① .稱取5mg辣根過氧化物酶(HRP)溶解在500 pLPBS中，逐滴 加入到1.5mg新霉素B中，形成混合液；
② .取60 mgEDC( l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)溶于200 雙蒸水中，逐滴加入到新霉素B和酶的混合液中，室溫攪拌反應l小時， 然后放于4"C連續攪拌過夜，形成反應液；
③ .將反應液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析96小時；
④ .精確量取酶偶聯物溶液的體積并測定濃度，加入硫柳汞后4 "C保存。
(4) .包被板的制備
新霉素B多克隆抗體包被于微孔板中，用pH 9.6 Na2C03—-NaHC03的 緩沖液將新霉素b多克隆抗體稀釋為0.5 pg/lOO mL作為包被液，96孔微孔 板每孔各加入100 室溫放置過夜或者37 。C恒溫溫育2 3小時，洗滌 液洗滌三次除去包被液，加入200ioL凍干液封閉1小時，洗滌液洗滌四次 后，凍干，4'C保存。
(5) .試劑組的組成
① .緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH7.4，使用時用二次水按1:5稀釋；
② .底物A:為含過氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；
③ .底物B:為含3,3'，5，5'-四甲基對二氨基聯苯(TMB)的二甲基亞砜 溶液；
.洗滌液為含2.5%吐溫的磷酸鹽緩沖液；使用時用二次水按照1:5 稀釋；
(D.終止液為1.25mol/L硫酸；
⑥ .凍干液Tris溶于100mL雙蒸水中，鹽酸調節pH 7.4，加入蔗 糖、乳糖、牛血清蛋白和抗壞血酸；
⑦ .新霉素B標準液其新霉素B標準溶液濃度為10mg/L,使用時 用磷酸鹽緩沖液(pH8.5)稀釋至100ng/L后，再按1:5稀釋六個梯度；
⑧ .酶標記新霉素B抗原溶液為新霉素B-辣根過氧化物酶連接物 (新霉素B-HRP)，使用時用緩沖液按照1:10萬倍稀釋。
⑨ .基質掩蔽劑0.5 %BSA/PBS溶液(pH 9.0 9.5)。 一種應用上述試劑盒定量檢測動物源性食品中新霉素B含量的檢測
方法該檢測方法的步驟為
a).用4x:低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液；該樣品前處理 是將樣品攪碎成均質，放于-2(TC儲存備用，取樣品加入萃取液，該萃取 液為磷酸緩沖液PBS，其pH8 9;然后低溫離心，取部分上清液用基質 掩蔽劑稀釋。
(2) .打開試劑盒取出包被板，分別將不同濃度的新霉素B標準液和樣品 提取液加入到包被板各自的微孔中，并且雙孔平行加樣，然后再在不同濃度 新霉素B標準液和樣品提取液各自的微孔中加入酶標記新霉素B抗原溶 液，震蕩混勻5min，室溫反應1 2小時；
(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內液體甩掉，用吸水紙扣干，加入 底物A和底物B的混合液，該底物A和底物B的混合液的配比為14.6:0.45， 室溫下反應0.4 0.6小時；
(4) .向各微孔中加入終止液，終止反應，用酶標儀讀取吸光度值，根據 不同濃度新霉素B標準液的吸光度值繪制新霉素B的標準曲線圖，對照新 霉素B的標準曲線圖得到樣品提取液中新霉素B的含量。
下面通過一具體實例，進一步說明本發明的先進性。 檢測雞肉樣品中新霉素B的含量
(1) .樣品前處理將雞肉經勻槳機充分攪碎成均質，于-2(TC儲存備用。 分別取雞肉樣品各1 g，加入10mL萃取液(PBS， pH8.5)，漩渦震蕩l 2min，低溫離心，取部分上清液用基質掩蔽劑5倍稀釋；
(2) .打開試劑盒取出包被板，分別將100 新霉素B梯度稀釋的標準 液和100pL樣品提取液雙孔平行加樣加入到包被板各自的微孔中，然后再 在新霉素b標準液和樣品提取液各自的微孔中各加入100 mL 1:10萬倍稀釋 的酶標記新霉素B抗原溶液，室溫反應1小時；
(3) .用洗漆液洗板3次；在每孔中加入150 底物A和底物B的混合 液，室溫下反應0.5小時；
(4) .向樣品提取液和新霉素B標準液各自的微孔中加入50 nL終止液， 進行終止反應，在雙波長方式(450 650nm)下用酶標儀讀取吸光度值，繪 制新霉素B的標準曲線圖，對照新霉素B的標準曲線圖得到樣品提取液中 新霉素B的含量。
(5) .結果的計算 ①.計算抑制率值
按公式(A)計算不同濃度新霉素B對抗原抗體結合反應的抑制率-
IC%:
^樣品-^空白
v4對照-^空白
x100 .................................... (A)
式中-
IC%——新霉素B對抗原抗體結合反應的抑制率；
A——450 nm吸光值與650 nm吸光值的差值；
A樣品——加入酶標及新霉素B標準液或樣液的平均吸光度值；
A空白——不加入酶標及新霉素B標準液的平均吸光度值。
A對照——只加入酶標不加入新霉素B標準液的平均吸光度值。
② .繪制標準曲線
以抑制率為縱坐標，新霉素濃度對數為橫坐標繪制校正曲線。每次試驗 均應重新繪制標準曲線，見圖l。
③ .結果計算
從圖1繪制的標準曲線上讀取樣液抑制率所對應的新霉素B濃度(C)， 按公式(B)計算試樣中的新霉素B殘留量
X=CxR .................................... (B)
式中
X——試樣中新霉素B殘留量，單位為微克每千克(pg/kg);
C—根據樣品孔的抑制率査得試樣中新霉素B濃度，單位為微克每
升
R——換算系數，例如雞肉為50。 加標試驗
在加標試驗中，分別向樣品中添加不同濃度的新霉素B，將加標樣品
充分混勻，室溫靜置過夜。其余處理過程同上。在對樣品雞肉的檢測中，
分別在25iig/kg、 100lig/kg和500 pg/kg水平進行加標回收試驗，其回收 率為75%和80%和85%。
權利要求
1.一種定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒，由試劑組和包被板構成，其特征在于其試劑組的組成為(1).緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH 7.3～7.5，使用時用二次水按1∶5稀釋；(2).底物A為含過氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；(3).底物B為含3，3′，5，5′-四甲基對二氨基聯苯的二甲基亞砜溶液；(4).洗滌液為含2.5％吐溫的磷酸鹽緩沖液，使用時用二次水按照1∶5稀釋；(5).終止液為1.25mol/L硫酸；(6).凍干液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調節pH 7.3～7.5，加入蔗糖、乳糖、牛血清蛋白及抗壞血酸；(7).新霉素B標準液其新霉素B標準溶液濃度為10mg/L，使用時用磷酸鹽緩沖液稀釋至100μg/L后，再按1∶5稀釋六個梯度；(8).酶標記新霉素B抗原溶液為新霉素B-辣根過氧化物酶的連接物新霉素B-HRP，使用時用緩沖液按照1∶10萬倍稀釋；(9).基質掩蔽劑0.5％BSA/PBS溶液，且其pH 9.0～9.5；其包被板的構成為包被板為96孔或48孔微孔板并在微孔中包被新霉素B多克隆抗體，采用Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將多克隆新霉素B抗體稀釋為包被液，向包被板中每孔各加入包被液，室溫放置過夜或者35～40℃恒溫溫育2～3小時，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干液封閉0.8～1.2小時，洗滌液洗滌四次后，凍干，3～5℃保存。
2. 根據權利要求1所述的定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑 盒，其特征在于所述的新霉素B多克隆抗體是選用雄性日本大耳白兔進 行六次免疫，三次免疫后IO天由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清 進行效價檢測，末次免疫后采用股動脈采血法對動物采全血，經離心處理 后收集全部血清，采取免疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加0.1%(W/V)的疊氮鈉后于4"C儲存備用。
3. —種采用如根據權利要求1所述的定量檢測動物源性食品中新霉素 B含量試劑盒的檢測方法，其特征在于其檢測方法的步驟是(1).用3 5 'C低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液； (2) .打開試劑盒取出包被板，分別將各種濃度的新霉素B標準液和樣品 提取液加入到包被板各自的微孔中，要雙孔平行加樣，然后再在各種濃度新 霉素B標準液和樣品提取液各自的微孔中分別加入酶標記新霉素B抗原溶 液，震蕩混勻5 10min，室溫反應1 2小時；(3) .用洗漆液洗包被板3 4次，將孔內液體甩掉，用吸水紙扣干，加入 底物A和底物B的混合液，室溫下反應0.4 0.6小時；(4) .向各微孔中加入終止液以終止反應，用酶標儀讀取吸光度值，根據 不同濃度新霉素B標準液的吸光度值繪制新霉素B的標準曲線圖，對照新 霉素B的標準曲線圖得到樣品提取液中新霉素B的含量。
4. 根據權利要求3所述的定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測方法，其特征在于所述的酶標記新霉素B抗原溶液的制備方 法是(1) .將辣根過氧化物酶HRP用磷酸鹽緩沖液PBS溶解，再將此酶溶 液逐滴加入到新霉素B中，形成混合液；(2) .將1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶于雙蒸水中，逐滴加 入到新霉素B和酶的混合液中，室溫攪拌反應0.8 1.2小時，然后放于3 5"C連續攪拌過夜，形成反應液；(3) .將反應液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析90 100小時；(4) .精確量取酶偶聯物溶液的體積并測定濃度，加入硫柳汞后3 5 °C 保存。
5. 根據權利要求3所述的定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測方法，其特征在于所述的底物A和底物B的混合液的配比為 14.6: 0.45。
6. 根據權利要求3所述的定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測方法，其特征在于所述的樣品前處理為將樣品攪碎成均質，放 于-20'C儲存備用，取樣品加入萃取液，低溫離心，取部分上清液用基質 掩蔽劑稀釋。
7. 根據權利要求6所述的定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測方法，其特征在于所述的萃取液為磷酸緩沖液PBS，其pH8 9。
全文摘要
本發明屬于免疫分析技術領域的一種定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒及其檢測方法，該試劑盒由包被板和試劑組構成，其中該試劑組的組成為緩沖液、底物A、底物B、洗滌液、終止液、凍干液、新霉素B標準液、酶標記新霉素B抗原溶液、基質掩蔽劑。本發明具有操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強、準確性好、檢測成本低等特點，而且適用范圍較廣，既有經濟效益又有社會效益，是一種創新性較高且具有良好的應用前景的定量檢測動物源性食品中新霉素B含量試劑盒及其檢測方法。
文檔編號G01N33/531GK101169412SQ20071015058
公開日2008年4月30日 申請日期2007年11月30日 優先權日2007年11月30日
發明者燕 張, 蓓 徐, 碩 王, 王忠斌 申請人:天津科技大學