一種多步連環選擇的血清核酸適配子體外篩選方法

專利名稱：一種多步連環選擇的血清核酸適配子體外篩選方法
技術領域：
本項發明屬生物醫學檢測分析技術領域，具體涉及一種將多步連環選擇應用于核酸適配子篩選和鑒定過程中的高效率血清核酸適配子體外篩選新技術。
背景技術：
核酸適配子是一種生物分子的人工單鏈核酸配體，通過SELEX (SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術從隨機單鏈寡核苷酸文庫中篩
選獲得。核酸適配子篩選所用文庫為人工構建，其中的單鏈寡核苷酸片段的兩端為固定序 列，中間為隨機序列。固定序列為PCR引物提供結合部位，便于SELEX篩選過程中進行PCR擴增，制備下一輪篩選的文庫。隨機序列使文庫中核酸序列的多樣性極為豐富，當隨機區長度為25個核苷酸，文庫中核酸多樣性理論上能達到IO15 ( 425=1. 12615)。單鏈寡核苷酸的一個獨特表現是容易形成各種形狀的二級結構和三級結構，如發夾、口袋、假結、凸環、G-四聚體(G-quartet)等，它們通過分子構象上的“鎖鑰”關系與靶分子適配，加上氫鍵、范德華力的作用，與靶分子形成穩定的復合物。多樣性達IO15的巨大庫容所擁有的豐富的寡核苷酸分子構象，可為自然界幾乎所有種類的分子找到匹配的核酸適配子。核酸適配子的功能與抗體類似，但與抗體相比具有許多優點①高特異性和高親和性能夠分辨出靶分子結構上細微的差別，親和力甚至強于天然配體；②靶標廣泛從有機小分子、生物大分子到病毒顆粒、完整細胞等均可作為篩選靶標；③穩定性好可長期保存，通過人工合成制備而無批間差異，可在常溫下運輸；④改建和修飾容易可在核酸適配子的特定部位進行精確的標記、修飾或核苷酸替換；⑤應用優勢無免疫原性，可在體內反復使用；分子小，方便于體內影像診斷和治療。目前核酸適配子的篩選與應用研究已涉及醫學的各個領域，包括基礎研究、臨床診斷、疾病治療和藥物研發等。SELEX技術是一種組合化學新技術，它利用化學合成的大容量單鏈隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，從中篩選出能與靶分子特異結合的寡核苷酸，并借助PCR擴增技術，使之指數富集，最終獲得高親和力、高特異性的核酸適配子。SELEX技術自1990年問世以來受到了廣泛關注，從技術本身到研究應用領域都得到了迅速發展。除了經典的SELEX篩選外，在結合其它方法的基礎上衍生出多種SELEX篩選方法，例如以熒光磁珠為介質衍生的熒光磁珠SELEX技術，以毛細管電泳為分離手段的毛細管電泳SELEX技術。此外，為適應某些特殊需求產生了切換SELEX、表達盒SELEX、基因組SELEX、消減SELEX、仿進化SELEX
坐寸ο用于SELEX篩選的靶標遠比抗體制備的靶標豐富，包括無機分子、生物小分子、生物大分子、病原微生物、真核細胞等。目前，通過SELEX技術已篩選出各種不同類型靶分子的核酸適配子，包括與基因調控有關的核酸結合蛋白(如噬菌體T4 DNA聚合酶、HIV-I Rev蛋白、核糖體蛋白SI)，非核酸結合蛋白(如凝血酶、各種細胞因子、輔因子、緩激肽、IgE抗體)，小分子有機物(如ATP、茶堿、氨基酸、維生素)，甚至金屬離子、多糖、有機染料，以及完整的細胞、病毒、孢子等。然而，盡管核酸適配子的篩選技術不斷發展，篩選用的靶標也不斷多樣化，但以血清為靶標篩選核酸適配子至今尚未見報道。其原因可能是血清成分過于復雜，其中正常組分(如白蛋白)占絕大部分，而與疾病相關的特異性物質(如腫瘤標志物)豐度很低，因此以血清為靶標進行核酸適配子篩選理論上難以獲得理想的篩選效果，篩選出的核酸適配子也難以鑒定，故是一個鮮有人探索的難題。然而，血清中含有已知和未知的各種疾病標志物，蘊藏著極為豐富的疾病發生、發展、診斷、治療、預后相關的信息。由于取材容易、對患者的創傷小，血清也是目前最為常用且十分理想的臨床標本。因此，建立可行、實用的以血清為靶標的核酸適配子篩選技術，有效篩選疾病標志物相關的特異性核酸適配子，建立基于核酸適配子的血清標本檢測和分析技術，對于探索疾病的發生、發展規律和獲取疾病的臨床診療相關信息，都具有十分重要的意義。

發明內容
本發明的目的創建一種血清核酸適配子體外篩選技術，不受血清個體差異和非特異性組分的影響，能高效率、高通量篩選出疾病特異的血清核酸適配子群，為建立基于核酸適配子的血清特性系統性分析技術奠定基礎。本發明采用的技術方案通過以混合血清為篩選靶標，消除個體差異；通過先以陰性混合血清進行反篩去除文庫中與非特異性血清成分結合的核酸序列并留下和富集不與非特異性血清成分結合的核酸序列，再以陽性混合血清正篩更有效地獲取特異性血清成分的核酸適配子；通過核酸適配子文庫PCR產物直接克隆測序分離單個核酸適配子；通過結構分析選擇代表性核酸適配子做后續鑒定，減少無意義工作；通過與陽性和陰性混合血清結合情況的對比分析選出高特異性的代表性適子；通過測定與陽性混合血清結合反應的解離常數選出高親和力的高特異性代表性核酸適配子；通過與陽性和陰性單個臨床血清標本結合情況的測定選出具有應用價值的特異性強、親和力大的核酸適配子。最終建立起將多步連環選擇貫穿于篩選和鑒定全過程的高效率血清核酸適配子體外篩選新技術。本發明的方法包括以下步驟。a.制備混合血清作為篩選靶標收集一組患有被研究疾病的患者的血清標本，等量混合制備成陽性混合血清；同時收集一組不患有被研究疾病的受試者的血清標本，等量混合制備成陰性混合血清。將混合血清用作核酸適配子篩選的靶標。b.核酸文庫及引物的設計與合成設計單鏈隨機寡核苷酸文庫和引物序列，人工合成。使用前用結合緩沖液分別配制成文庫和引物溶液。c.用陰性混合血清進行反向篩選將步驟a制備的陰性混合血清與步驟b制備的文庫(原始文庫)孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收游離核酸，以游離核酸為模板進行PCR擴增并回收和純化單鏈寡核苷酸，重復若干輪上述孵育-回收-制備，當凝膠電泳顯示結合核酸條帶明顯減弱、游離核酸條帶明顯增強時，停止篩選，定量后作為下一輪篩選的亞文庫；重復若干輪上述孵育-回收-制備，當凝膠電泳顯示結合核酸條帶明顯減弱、游離核酸條帶明顯增強時，停止篩選。d.用陽性混合血清正向篩選將步驟a制備的陽性混合血清與步驟c最后一輪反向篩選后制備的亞文庫(二級文庫)孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收結合核酸，以結合核酸為模板進行PCR擴增，回收和純化單鏈寡核苷酸，定量后作為下一輪篩選的亞文庫；重復若干輪上述孵育-回收-制備，并逐輪增加核酸與血清的量比，當凝膠電泳顯示結合核酸條帶明顯、游離核酸條帶明顯減弱趨于消失時，停止篩選。e.克隆測序分離單個核酸適配子以步驟d最后一輪正向篩選后制備的亞文庫(核酸適配子文庫)為模板進行PCR擴增，對擴增產物直接進行克隆分離和核酸測序；將測序結果與所設計文庫的序列進行比對，將兩端固定序列區與文庫相同、中間隨機序列區長度與文庫相同的核酸序列確定為核酸適配子。
f.單個核酸適配子的結構分析對步驟e確定的核酸適配子的核苷酸序列進行二級結構的計算機模擬分析，按序列同源性進行聚類分析和家族劃分，對同一家族核酸適配子通過同源性比對找出主要基序。根據二級結構模擬分析及同源性分析結果選出代表性核酸適配子。g.核酸適配子的特異性分析將步驟f選出的代表性核酸適配子分別與陰性混合血清和陽性混合血清孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳及核酸染色，觀察游離核酸適配子帶的強弱，采集圖像并用凝膠分析軟件測定游離核酸適配子帶的灰度值，計算陰性混合血清與陽性混合血清的游離核酸適配子帶的灰度比值，選出特異性強的核酸適配子(灰度比值越大，核酸適配子的特異性越強)。h.核酸適配子的親和力分析將步驟g選出的特異性強的代表性核酸適配子配成梯度濃度，與陽性混合血清孵育后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，采集圖像并測定各梯度點結合核酸適配子帶的灰度值，計算解離常數Kd，選出親和力大的核酸適配子(Kd值越小,親和力越大)。i.核酸適配子應用價值分析將步驟h選出的特異性強、親和力大的核酸適配子分別與單個陽性血清標本和陰性血清標本孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，測定各標本的游離核酸適配子帶的灰度值，計算各標本與核酸適配子對照(以結合緩沖液代替血清標本進行實驗)的灰度比值，統計分析兩類標本之間的灰度比值差異以及核酸適配子對陽性和陰性標本的判別能力。選出應用價值大的核酸適配子(鑒別兩類標本的能力越強，核酸適配子的應用價值越大)供后續研究應用。其中上述步驟中所述的血清標本為抽取患者空腹狀態下的外周靜脈血標本,凝固后常規離心分離血清，_80°C保存備用。取20例左右患有所研究疾病的患者的血清等量混合制成陽性混合血清。取20例左右不患有所研究疾病的患者或正常人的血清等量混合制成陰性混合血清。其中上述步驟中所述的單鏈隨機寡核苷酸文庫是指用于SELEX篩選的人工設計并化學合成的文庫。文庫中的寡核苷酸為單鏈，兩端為固定序列(為PCR擴增時提供引物結合部位)，中間為隨機序列(使單鏈寡核苷酸鏈能形成各種不同的分子構象)。上游引物與文庫的5’端固定序列相同，下游引物與文庫的3’端固定序列互補。結合緩沖液的成分為20mM Hepes-Na,120mM NaCl,5mM KCl,ImM CaCl2,1 mM MgCl20其中上述步驟中所述的聚丙烯酰胺凝膠及核酸染色具體如下血清與文庫(或核酸適配子)孵育后觀察核酸與血清的結合情況、目的條帶的灰度測定和切膠回收使用含10%甘油的10°/Γ12%中性聚丙烯酰胺凝膠；不對稱PCR擴增產物切膠回收使用含7Μ尿素的8%變性聚丙烯酰胺凝膠；核酸染色采用硝酸銀染色(觀察時)或核酸熒光染料GelRed染色(觀察或切膠回收時)。其中上述步驟中所述的從凝膠中回收核酸采用冷凍壓榨法，或采用電洗脫法；純化核酸采用酚-氯仿抽提后使用市售核酸沉淀劑共沉淀法。其中上述步驟中所述的核酸PCR擴增具體如下亞文庫制備使用不對稱PCR擴增后尿素變性膠回收單鏈寡核酸，或使用對稱PCR擴增后變性雙鏈產物再選擇回收單鏈寡核苷酸；亞文庫的核酸定量采用熒光定量PCR法；核酸適配子克隆測序所用的核酸采用常規對稱PCR擴增。其中上述步驟中所述的核酸適配子二級結構摸擬分析采用RNA structure 4. 6軟件或具有類似功能的軟件完成，核酸適配子同源性的家族聚類分析、各家族的主要基序尋找采用Clustal X軟件或具有類似功能的軟件完成。
其中上述步驟中所述的灰度測定是凝膠電泳和核酸染色完成后，借助紫外透射儀及其紫外濾光配件用數碼相機拍攝圖像，或通過電泳凝膠分析系統采集圖像，再通過電泳凝膠分析軟件測定目的條帶的灰度值。其中上述步驟中所述的核酸適配子與陽性混合血清結合的解離常數(Kd)分析使用Graphpad prism 5軟件或具有類似功能的軟件完成。其中上述步驟中所述的核酸適配子對照是以結合緩沖液代替血清進行實驗，每塊凝膠設一個核酸適配子對照。各標本的游離核酸適配子帶的灰度值分別除以同一塊凝膠的核酸適配子對照的灰度值，即得到各標本的游離核酸適配子帶的灰度比值。其中上述步驟中所述的核酸適配子對陽性標本和陰性標本的鑒別能力采用受試者工作特征(ROC)曲線進行分析，觀察曲線下面積(AUC)，并確定最佳界值后計算鑒別的敏感度、特異度和準確度。本發明的有益效果本發明方法有效解決了以血清為靶標的核酸適配子篩選技術問題，能高效率篩選出疾病特異性的血清核酸適配子。目前篩選單一靶分子(如純化的某種蛋白質)或單一靶標(如均一的某種細胞)的核酸適配子目前并不存在技術問題，而血清是成分十分復雜的液態系統，其中含有大量非特異性成分，而與疾病相關的特異性生物標志物含量很低，要以血清為靶標篩選出這些低豐度的疾病特異性標志物的核酸適配子，必須解決血清中大量非特異性組分對篩選的干擾這個技術難題。本發明方法通過新穎的技術思路和設計方案，從篩選、鑒定直到應用價值驗證，多步驟連環選擇，形成一個嚴謹而高效的篩選系統，最終達到克服血清大量非特異性成分的干擾而有效篩選出特異性的核酸適配子的目的。血清中含有各種已知和未知的疾病相關的生物標志物，是探討疾病的發生、發展、診斷、治療和/或預后的重要靶分子。本發明方法直接以血清為靶標進行篩選，高通量篩選出各種標志物的核酸適配子，為建立基于核酸適配子的血清分析技術進而系統性探索疾病的發生發展規律和獲取臨床診療相關信息奠定了良好的基礎。本發明方法可用于各種疾病血清中特異性成分(標志物)的核酸適配子篩選，特別是腫瘤新的生物標志物的研究和應用，實用價值大，應用前景廣闊。


圖I為本發明方法的技術流程圖。
圖2為切膠回收的核酸不對稱PCR擴增后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色的結果。泳道Γ4為擴增產物進行12%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可見擴增產物中的單鏈DNA (紅色smear)和雙鏈DNA (深色條帶)混在一起。泳道M為20bp DNA marker 圖3為與圖2對應的擴增產物進行含7M尿素的8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色的結果。可見單鏈DNA (紅色條帶)和雙鏈DNA (深色條帶)已很好地分開，便于切膠回收；泳道1^為20bp DNA marker ο
圖Γ圖6為克隆分離出的陽性血清核酸適配子之一。其中圖4為該核酸適配子的核酸預序圖，圖5為該核酸適配子的核酸序列，圖6為該核酸適配子的二級結構模擬圖。圖疒圖9為克隆分離出的核酸適配子進行序列同源性分析后幾個不同家族的保守序列。其中，圖7為第一家族中以T/GGGT為保守序列的核酸適配子；圖8為第二家族中以GT-TGT為保守序列的核酸適配子；圖9為第三家族中以T(C/T)GG為保守序列的核酸適配子。圖10、圖11為核酸適配子與陽性混合血清結合的特異性分析結果。其中，圖10為將梯度濃度的核酸適配子分別與陽性和陰性混合血清孵育，然后進行12%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳和GelRed染色，第I、3、5、7、9泳道對應的核酸適配子量為2、3、4、5、6pmol，與之孵育的血清均為2 μ I陽性混合血清，第2、4、6、8、10泳道對應的核酸適配子量為2、3、4、5、6pmol，與之孵育的血清均為2 μ I陰性混合血清；圖11為圖10中相同核酸適配子量點的陰性與陽性混合血清的游離核酸適配子帶的灰度比值。圖12、圖13為核酸適配子與陽性混合血清結合的親和力測定結果。其中，圖12為將梯度核酸適配子量與陽性混合血清孵育后進行中性聚丙烯酰胺凝膠電泳及GelRed染色，泳道Γ8分別對應l、2、3、4、5、6、7、8pmol的核酸適配子量(濃度O. 083 O. 667 μ M)，陽性混合血清2 μ I ;圖13為測定各泳道結合帶的灰度值并計算其構成比,Graphpad prism 5軟件作圖計算核酸適配子與陽性混合血清結合的解離常數(Kd)。圖14、圖15為核酸適配子與臨床血清標本結合程度分析。核酸適配子與血清孵育后進行12%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳及GelRed染色。其中，圖14中泳道f 8為不同肝癌血清標本，AP為核酸適配子對照；圖15中泳道廣7為不同正常血清標本，AP為核酸適配子對照。從圖14、15中可見核酸適配子與肝癌血清標本的結合帶明顯強于正常血清標本，而游離帶則明顯弱于正常血清標本。
具體實施例方式以下通過肝癌血清核酸適配子篩選的具體實施例，對本發明的方法作進一步說明。I.靶血清收集與處理。收集20例手術及病理確診的原發性肝癌患者術前外周血非抗凝標本，每例2ml左右，性別、年齡不限。同時收集20例正常體檢人員的外周血非抗凝標本，性別、年齡不限，B超肝臟未見異常，乙肝表面抗原、HCV抗體、AFP均為陰性，肝腎功能正常。血標本常規離心，分離血清，分裝后置_80°C冰箱保存備用。使用前將所收集的20例肝癌血清各取50 μ I混勻，瞬間離心，制備成肝癌混合血清，50μ I/管分裝，-20°C冰箱保存備用。以同樣的方法制備并保存正常混合血清。
2.文庫與引物的設計與合成。自行設計文庫，兩端固定序列19nt，中間隨機序列為40nt，具體序列如下5' -ACCGAC CGT GCT GGA CTC T (N40) AGT ATG AGC GAG CGT TGC G-3/。上游引物與文庫的5'端固定序列相同，下游引物與文庫的3'端固定序列互補，具體序列如下5' -ACCGAC CGTGCT GGA CTC T-3'，5' -CGC AAC GCT CGC TCA TAC T-3'。文庫與引物均由上海Sangon公司合成，合成量為2 OD。3.以正常混合血清為靶標的反向篩選。將正常混合血清與合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫孵育，切膠回收不與血清結合的游離核酸，不對稱PCR擴增制備亞文庫，用于下一輪篩選。具體步驟如下。( I)文庫與正常混合血清孵育。 I) 將200 μ I結合緩沖液加入20D合成文庫，震蕩混勻，瞬間離心。2) 將文庫溶液置99°C變性5min，冰浴5min。3) 加入600 μ I正常混合血清，90 μ I甘油。4) 37°C水浴60min，期間不時搖動。(2 )聚丙烯酰胺凝膠電泳。I) 配制含10%甘油的12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳膠模，灌膠，室溫下放置60min以上，凝固后備用。3) 將膠板裝配于垂直電泳槽中，加入預冷O. 5 ΤΒΕ，預電泳lOmin。4) 將上述文庫與正常血清孵育后的反應液上樣電泳，200V，40min。(3) GelRed 凝膠染色。I) 取 46ml ddH20 于平皿中。2) 加入I. 25M氯化鈉溶液4ml，再加入GelRed染料15 μ 1，混勻。3) 電泳結束后取下凝膠片，放入染液中染色20min。4) 紫外燈下觀看結果，拍照存檔。(4)切膠回收游離單鏈寡核苷酸(ssDNA)。I) 用手術刀片切下游離ssDNA條帶(40bp lOObp)。2)將膠條移至5ml規格的一次性注射器內，搗碎凝膠條并加壓由注射器針頭擠出，1.5ml EP管收集。3) 加 IXTE 緩沖液(ρΗ8·0) 400μ 1，置于-20°C 30min 后，立即 48°C水浴30mino4) 重復上一步驟2次。5) 將上清移至新的EP管中。6) 12000r/min 4°C離心5min,將上清轉移到另一離心管。(5)酚/氯仿抽提純化ssDNA。I) 在上一步驟得到的上清液中加入等體積Tris飽和酚，充分混勻后，12000r/min 4。。離心 lOmin。2) 小心吸取上層液體至新的EP管。3) 加入等體積氯仿，振蕩，充分混勻后，12000 r/min 4°C離心lOmin。4) 小心吸取上層液體至新的EP管。
(6)核酸共沉淀劑沉淀ssDNA。I) 在上一步驟得到的溶液中加入1/10體積3M NaAc溶液，混勻。2) 加入DNAmate溶液，混勻(當溶液體積小于400 μ I時，DNAmate用量均為4 μ I,大于400 μ I時，按每100 μ I增加I μ I的比例增加DNAmate用量)。3) 加入2. 5倍體積_20°C預冷的無水乙醇，充分混勻。4) 12000 r/min 4 離心 15min。5) 棄上清，沉淀用-20°C預冷的70%乙醇清洗一次，室溫下干燥。6) 用60 μ I TE Buffer溶解沉淀，作為不對稱PCR擴增的模板。(7)不對稱PCR擴增回收的ssDNA。I) 設25管平行管,反應體系50 μ I,包括如下成分
2IPCRMIX25 μ I
上游引物1·5μ1(0·75μΜ)
下游引物L 5μ 1 (0. 0375μΜ)
ssDNA 模板2 μ I
ddH2020 μ Io2)PCR 擴增條件94°C 3min,94°C 45s，68°C 90s, 20 個循環，最后 72°C延伸7min。(6 )不對稱PCR產物銀染色鑒定。I) 配制12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳凝膠模板，灌膠，室溫下放置60min以上，凝固后備用。3) 將膠板裝配于電泳槽中，加入 ΤΒΕ緩沖液。4) 將5 μ I PCR產物與I μ I上樣緩沖液混勻上樣。5) 200V電泳，當溴酚藍泳動至凝膠底端即停止電泳。6) 小心取下凝膠片，標記好左右，置于IOOml銀染固定液中，l(Tl5min。7) ddH20 沖洗 2 次，IOs/次。8) 加入O. 2%硝酸銀溶液100ml，染色IOmin。9) ddH20 沖洗 3 次，IOs/次。10)加100ml DNA銀染顯色液，直至出現清晰的DNA條帶。11)判讀結果，當在dsDNA條帶上下見到smear,即為ssDNA。12)掃描圖像，保存于電腦。(7)尿素變性膠電泳回收ssDNA。I) 配制含7M尿素的8%聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳膠模板，灌膠，室溫下放置60min以上待凝固。3) 將膠板裝配于電泳槽中，加入 ΤΒΕ緩沖液。4) 將5 μ I PCR產物與I μ I上樣緩沖液混勻，上樣，200V電泳40min。5) 小心取下凝膠片，GelRed核酸染料染色10 30min。6) 紫外燈下觀察，ssDNA條帶泳動速度慢于dsDNA。7) 用手術刀片切下ssDNA條帶，擠壓、反復凍融法回收ssDNA (步驟同前)。8) 酚-氯仿純化ssDNA (步驟同前)。
9) 核酸共沉淀劑沉淀ssDNA (步驟同前)。(8)實時熒光定量PCR定量回收純化的ssDNA。將回收的ssDNA溶液作為模板，進行熒光定量PCR擴增。I) 反應體系20 μ I,包括如下成分
2iEvagreen PCR MIX 10 μ I
上游引物I μ 1(10 μ Μ)
下游引物I μ 1(10 μ Μ)
ssDNA 模板2 μ I
ddH206 μ I ο2) 0 擴增條件9413111丨11;941458，681908，20個循環；最后721 7min。3) 同時以倍比稀釋的原始文庫溶液(含單鏈寡核苷酸ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、108、IO9個拷貝)為模板進行熒光定量PCR擴增制備標準曲線。4) 將ssDNA拷貝數濃度換算成摩爾濃度，計算回收的ssDNA總量，作為亞文庫，用于下一輪篩選。 經3輪篩選后在電泳凝膠上見結合帶明顯減弱，游離帶明顯增強，反篩結束。4.以肝癌混合血清進行正向篩選。將肝癌混合血清與上述3輪消減SELEX后的亞文庫進行孵育，切膠回收與血清結合的核酸，不對稱PCR擴增，切膠回收純化后用作下一輪篩選的文庫。具體步驟如下。(I)肝癌混合血清與上述亞文庫孵育將亞文庫液99°C熱變性5min，冰浴5min，按預定比例加入肝癌混合血清(核酸/血清比從2pmol : I μ I開始，兩者比例隨篩選輪次增加而逐步增加)，37°C孵育3(T60min (孵育時間隨篩選輪次增加而逐步縮短)，期間不時搖動。(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟同前述正常混合血清反向篩選。(3) GelRed凝膠染色步驟同前述正常混合血清反向篩選。(4)切膠回收結合ssDNA :切取核酸與血清的結合條帶，步驟同前述正常混合血清反向篩選。(5)酚-氯仿抽提純化ssDNA :步驟同前述正常混合血清反向篩選。(6)核酸共沉淀劑沉淀ssDNA :步驟同前述正常混合血清反向篩選。(7)不對稱PCR擴增回收的ssDNA :步驟同前述正常混合血清反向篩選。(8)不對稱PCR擴增產物銀染色鑒定步驟同前述正常混合血清反向篩選。(9) 7M尿素變性膠電泳回收ssDNA條帶步驟同前述正常混合血清反向篩選。(10)回收純化ssDNA實時熒光定量PCR定量步驟同前述正常混合血清反向篩選。以肝癌混合血清進行正向SELEX篩選過程中，隨著篩選輪次的增加，文庫與肝癌混合血清的結合不斷增多，表明能與肝癌血清結合的核酸不斷被富集，至第9輪時，文庫與血清的結合已非常明顯，故而終止篩選。5.克隆法分離單個核酸適配子
以第9輪篩選后制備的亞文庫為模板進行PCR擴增，獲得dsDNA，送上海Sangon公司克隆分離單個核酸適配子，并測定核酸序列。(I)亞文庫的對稱PCR擴增。
I) 設平行管10管，反應體系50 μ 1，包括如下成分
2IPCRMIX25 μ I
上游引物1·5μ1(0·75μΜ)
下游引物1·5μ1(0·75μΜ)
核酸適配子文庫模板2μ1 ddH2020 μ Io2) PCR擴增條件94°C 3min, 94°C 45s，68°C 90s, 8 個循環，最后 72°C延伸 7min。(2) 12%中性膠鑒定PCR產物。I) 配制12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳膠模板，灌膠，室溫下放置60min以上待凝固。3) 將膠板裝配于泳槽中，加入 ΤΒΕ緩沖液。4) 將5 μ I的PCR產物與I μ I上樣緩沖液混勻，上樣，200V電泳，當溴酚藍泳至凝膠底端時結束電泳。5) 取下膠片GelRed染色，紫外燈下觀察結果。(3)克隆測序。將PCR產物送上海Sangon公司，回收目的片段，克隆測序。前后共分離出200多條核酸序列，經與文庫序列比對，去除序列重復者，成功分離到182個肝癌血清核酸適配子。6.核酸適配子的二級結構模擬分析。(I)將核酸適配子的測序圖譜用Chromas軟件打開，導出意義序列到文本文件并保存。(2)打開RNA structure 4. 6軟件，點擊file,在下拉菜單中點擊“newsequence",出現一個分析新序列的對話框，將(I)中保存的序列粘貼到對話框中的sequence 欄中。(3)點擊 “Fold as DNA”，出現 “the sequence has been edited. Savechanges ”，點擊 “Yes”。(4)將文件保存到文件夾中，出現對話框，點擊“Start”，出現對話框，點擊“drawstructures”,出現軟件模擬的核酸適配子的二級結構和折疊所需最低能量。(5)將核酸適配子二級結構復制、保存。二級結構分析顯示所分離出的核酸適配子有豐富的二級結構，包括發夾、假結、凸環、口袋、棒形和球拍形等多種構象，二級結果折疊所需的最低能量從-19. 6到-7. 3不等。7.核酸適配子的同源性分析。(I)將所有核酸適配子序列整理成FASTA格式保存為txt文檔。(2)打開Clustal X軟件，點擊“file”,在下拉菜單中點擊“load sequences”,選取(I)中保存的文檔，此時文檔中多條序列會導入到主界面上。(3)打開Clustal X軟件，點擊“tree”,在下拉菜單中點擊“draw tree”,系統會自動構建進化樹。 (4)根據進化樹親緣關系將核酸適配子劃分家族。(5)將同一家族的核酸適配子整理成FASTA格式，按照(2)方法導入軟件中，點擊“Alignment”,在下拉菜單中點擊“Do complete alignment”。(5)序列會根據軟件提供的參數進行全序列比對，比對結果會出現在主界面上，保守序列用*標記，同時軟件會自動保存與txt相同文件名的比對結果到txt所在的文件夾中。經同源性分析，全部核酸適配子可聚類成3個大家族。第一家族中以GGT為主流基序，同時還有TGA和GATG等基序，第二個家族主要是C(G/A)GT、GCAGT等，第3家族只有一個基序T(C/T)GG。從不同家族中選出15個代表性核酸適配子進行后續分析。8.核酸適配子與肝癌血清結合的特異性分析。采用中性聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度測定方法分析15個代表性核酸適配子與肝 癌血清結合的特異性。具體步驟如下。(I)配制12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液，裝配垂直電泳膠模，灌膠，室溫下放置60min以上待凝固，使用前200V預電泳lOmin。(2)按下表配制核酸適配子的梯度混合液、變性及與血清孵育。
權利要求
1.一種多步連環選擇的血清核酸適配子體外篩選方法，其特征是包括以下步驟 a.收集一組患有被研究疾病的患者的血清標本,等量混合制備成陽性混合血清；同時收集一組不患有被研究疾病的受試者的血清標本，等量混合制備成陰性混合血清； b.設計單鏈隨機寡核苷酸文庫和引物序列，人工合成，用結合緩沖液分別配制成文庫和引物溶液； c.將陰性混合血清與步驟b制備的文庫溶液孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收游離核酸，以游離核酸為模板進行PCR擴增并回收和純化單鏈寡核苷酸，定量后作為下一輪篩選的亞文庫；重復若干輪上述孵育-回收-制備，當凝膠電泳顯示結合核酸條帶明顯減弱、游離核酸條帶明顯增強時，停止篩選； d.將陽性混合血清與步驟c最后一輪篩選后制備的亞文庫孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收結合核酸，以結合核酸為模板進行PCR擴增，回收和純化單鏈寡核苷酸，定量后作為下一輪篩選的亞文庫；重復若干輪上述孵育-回收-制備，并逐輪增加核酸與血清的量比，當凝膠電泳顯示結合核酸條帶明顯、游離核酸條帶明顯減弱趨于消失時，停止篩選； e.以步驟d最后一輪篩選后制備的亞文庫為模板進行PCR擴增，對擴增產物直接進行克隆分離和核酸測序；將測序結果與所設計文庫的序列進行比對，將兩端固定序列區與文庫相同、中間隨機序列區長度與文庫相同的核酸序列確定為核酸適配子； f.對步驟e確定的核酸適配子的核苷酸序列進行二級結構的計算機模擬分析，按序列同源性進行聚類分析和家族劃分，對同一家族核酸適配子通過同源性比對找出主要基序，選出代表性核酸適配子； g.將步驟f選出的代表性核酸適配子分別與陰性混合血清和陽性混合血清孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳及核酸染色，觀察游離核酸適配子帶的強弱，采集圖像并用凝膠分析軟件測定游離核酸適配子帶的灰度值，計算陰性混合血清與陽性混合血清的游離核酸適配子帶的灰度比值，選出特異性強的核酸適配子； h.將步驟g選出的特異性強的代表性核酸適配子配成梯度濃度，與陽性混合血清孵育后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，采集圖像并測定各梯度點結合核酸適配子帶的灰度值，計算解離常數Kd，選出親和力高的核酸適配子； i.將步驟h選出的核酸適配子分別與單個陽性血清標本和陰性血清標本孵育，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，測定各標本的游離核酸適配子帶的灰度值，計算各標本與核酸適配子對照的灰度比值，統計分析兩類標本之間的灰度比值差異以及核酸適配子對陽性和陰性標本的判別能力，選出應用價值大的核酸適配子。
2.利用權利要求I項中所述的任一步驟建立的血清核酸適配子篩選技術。
全文摘要
一種多步連環選擇的血清核酸適配子體外篩選方法，屬生物醫學檢測分析技術領域，其特征是通過以混合血清為篩選靶標消除個體差異，先以正常血清反篩去除文庫中能與非特異性血清成分結合的核酸序列，再以混合血清正篩繼而克隆測序分離核酸適配子，通過對核酸適配子的結構模擬分析、特異性分析、親和力分析和應用價值分析，優選出應用價值大的核酸適配子。本發明克服了血清中大量非特異性成分的干擾，可以直接以血清為靶標高通量篩選出血清中疾病特異性成分的核酸適配子，既高效又經濟，可為建立基于核酸適配子的分析技術并系統性探索疾病的發生發展規律和獲取臨床診療相關的生物信息奠定基礎，具有良好的應用價值。
文檔編號C12N15/10GK102732505SQ20121004541
公開日2012年10月17日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者呂農華, 張吉翔, 張焜和, 徐國峰, 曾琴, 王婷, 陳文學, 魏淑琴 申請人:南昌大學