專利名稱：篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法
技術領域：
本發明涉及以胱天蛋白酶(caspase)-14對鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的分解為指標，篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法。
背景技術：
角質細胞由于終末分化，對有害環境形成被稱為“角質層”的保護屏障、角質層細胞間隙的脂類在該保護屏障中發揮重要的作用。角質層細胞間隙的脂類，在表皮角質細胞中與分化同時生物合成，積累在角質小體中。角質 層細胞間隙的脂類的主要成分神經鞘胺醇，是通過葡糖腦苷脂酶切斷由角質小體的胞吐作用釋放到角質層細胞間隙中的葡糖神經鞘胺醇的糖鏈而生成的。此外，已知在其他途徑中，由鞘磷脂酶將鞘髓磷脂分解為神經鞘胺醇。作為鞘脂類活化蛋白質的鞘脂激活蛋白(saposin)是水解鞘脂類必需的蛋白質，已知存在4種鞘脂激活蛋白(鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D)。由于鞘脂激活蛋白是作為產生角質層細胞間隙脂類必需的神經鞘胺醇合成酶(例如葡糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶等)的輔酶作用的因子，所以認為鞘脂激活蛋白對皮膚屏障功能而言是重要的。迄今為止，已確認鞘脂激活蛋白A、C、D如果在內臟中積累，則產生溶酶體忙積癥(例如，Gaucher氏病、Niemann-Pick病)，鞘脂激活蛋白原(prosaposin)基因的突變造成神經損傷性的表型。已報道了在患有與皮膚相關的特應性皮炎或牛皮癬的患者中，鞘脂激活蛋白原降低(分別參見Tezuka等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323 和 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400)。已知在各種皮膚疾病(例如特應性皮炎、牛皮癬、接觸性皮炎等)中可見的皮膚粗糙癥狀中，水分從皮膚的喪失比健康皮膚更旺盛。所謂的水分透皮蒸發量(TEWL)的增加可以認為與承擔保持皮膚內的水分或作為屏障功能的成分減少相關。迄今為止，已報道了伴隨著皮膚屏障功能降低，皮膚的皮膚功能降低，其結果是出現皮膚增殖性異常的情況。特別是在高齡對象的情況下，由于恢復已降低的皮膚屏障功能花費長的時間，因而需要新型皮膚屏障功能恢復劑，所述新型皮膚屏障功能恢復劑對于阻止隨年齡增加而導致皮膚的皮膚功能降低所造成的皮膚增殖性異常等有效。對所研究的包括促進皮膚屏障功能恢復的制劑等化妝品在內的物質，必須在動物實驗中確認其效果。然而，近年來，在化妝品研發的實際情況中，具有出于倫理的觀點限制動物實驗的傾向，對不用動物而篩選候選物質的方法需求變高。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻l:Tezuka 等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323
非專利文獻2 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400
發明內容
發明要解決的課題本發明的課題是提供使用新型指標的恢復皮膚屏障功能的物質的篩選方法。解決課題的手段胱天蛋白酶(caspase) -14是胱天蛋白酶(caspase)家族的最新成員，主要在分化的角質細胞中表達。胱天蛋白酶-14鑒定出了胱天 蛋白酶家族成員間相同的EST。根據最近的研究顯示，角質化細胞中的胱天蛋白酶-14加工變成異二聚體，之后表現出對與胱天蛋酶-I對應的合成底物Trp-Glu-His-Asp-AFC的酶的活性(MikolajczykJ.等人，Biochemistry 43，10560-9 (2004))。這一水解活性對蛋白質分解切割和親液鹽的存在是必需的。胱天蛋白酶-14的一級結構與炎性胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶(caspase) -I、_4和-5)非常相似，但胱天蛋白酶(caspase) -14僅限于分化的角質細胞中表達，提示與角質細胞終末分化中的其他形態相關(Lippens S.等人，Cell DeathDiffer. 7，1218-24(2000))。然而，尚未了解胱天蛋白酶_14的活化機制、天然底物或調節因子。在本文中，本發明人從分化的培養人表皮角質化細胞(NHEK )提取物中分離與胱天蛋白酶-14結合的蛋白質，進行LC/MS/MS分析，從結合胱天蛋白酶-14的蛋白質中鑒別出鞘脂激活蛋白原(prosaposin)。本發明人發現了鞘脂激活蛋白原在從基底層至顆粒層中表達，而鞘脂激活蛋白A在顆粒層最上層部分中表達，此外，胱天蛋白酶-14參與鞘脂激活蛋白原的加工，產生鞘脂激活蛋白的中間體和鞘脂激活蛋白A，從而完成了本發明。因而，本申請包括以下發明(I)篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法，該方法包括在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步驟,和與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解為鞘脂激活蛋白(saposin) A時，選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。(2)在(I)中記載的方法,通過使用抗鞘脂激活蛋白(saposin) A抗體的蛋白質印跡方法評估上述分解。發明的效果一直以來，已知在體外實驗中，胱天蛋白酶-14僅在存在高濃度的親液鹽(例如檸檬酸)的條件下表現出活化作用。因此，一直不清楚胱天蛋白酶-14在體內實現的功能。此次，本發明人首次明確了在不添加親液鹽的條件下胱天蛋白酶-14限定分解鞘脂激活蛋白原，產生鞘脂激活蛋白的中間體和鞘脂激活蛋白A(圖I)。本發明人通過免疫染色進一步明確了鞘脂激活蛋白原(prosaposin)在從基底層至顆粒層中表達，此外，鞘脂激活蛋白A存在于皮膚的顆粒層上部(圖2)。根據以上結果，認為胱天蛋白酶-14在生物體內有利于鞘脂激活蛋白原的加工。
鞘脂激活蛋白原的分解產物鞘脂激活蛋白作為生成角質層間隙的脂類所必需的神經鞘胺醇合成酶的輔助因子發揮作用，是形成表皮屏障所必需的，根據本發明的方法，以胱天蛋白酶-14分解成鞘脂激活蛋白A為指標，可以不進行動物實驗，而研究新型的促進皮膚屏障功能恢復的物質。
圖I :在存在或不存在胱天蛋白酶(caspase) -14的條件下，顯示鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的加工的示意圖。圖2 :顯示人正常皮膚中的鞘脂激活蛋白原(prosaposin)和鞘脂激活蛋白A的局部分布的免疫染色圖。
具體實施方式
本發明提供了篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法，該方法包括在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步驟，和與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解為鞘脂激活蛋白(saposin) A時,選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。本發明方法中使用的候選物沒有限制，可以考慮例如活化胱天蛋白酶(caspase) -14,由此促進鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解的物質。胱天蛋白酶-14是半胱氨酸蛋白酶，因此，還原劑或具有還原作用的物質，例如巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等試劑、谷胱甘肽等生物體內的物質、具有還原作用的植物提取液可以成為該候選物。在存在該候選物的條件下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原，當與對照相比顯著促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A時，可以選擇該候選物作為促進皮膚屏障功能恢復的物質。作為其評價標準，例如對于鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解為鞘脂激活蛋白(saposin)A，與使用對照物作用的情況相比，如果增加了 10%以上、或20%以上、或30%以上、或50%以上、或70%以上、或100%以上，則可以判斷為“顯著促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A”。可以通過使用抗鞘脂激活蛋白A抗體的蛋白質印跡方法評估鞘脂激活蛋白原向鞘脂激活蛋白A的分解。該抗體優選是抗鞘脂激活蛋白A特異性的抗體。然而，本發明不限于該方法。可認為通過本發明的篩選方法選擇出的試劑，對于需要恢復皮膚屏障功能的皮膚，例如由于皮膚病、各種壓力和皮膚粗糙等造成皮膚屏障功能降低的肌膚、由于植皮造成沒有充分形成皮膚屏障層的皮膚屏障功能低下的肌膚，或者由于移植造成皮膚屏障功能降低的肌膚等的改善是有效的。本說明書中使用的術語“皮膚屏障功能”指通過皮膚特別是表皮將體內的水分保持，以及阻止病毒、細菌等進入等。在本文中，可以通過測量不出汗的條件下的水分透皮蒸發量(TEWL)(單位g/m2*h)，評估該功能。因此，通過在皮膚上適用通過本發明選擇出的作為恢復皮膚屏障功能的物質的試劑，測量TEWL，可以確定該試劑實際上是否能夠使皮膚屏障功能恢復。
進而，在其他形態中，提供了用于促進皮膚屏障功能恢復的方法，該方法包括活化胱天蛋白酶-14，促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A。本發明的促進皮膚屏障功能恢復的方法，優選作為美容方法提供。然而，該方法不限于美容方法，也根據要恢復皮膚屏障功能的皮膚癥狀，出于治療目的來進行。本發明的方法是在需要該功能恢復的患者中，通過適用活化胱天蛋白酶-14的物質，例如還原劑，來實施。適用方法沒有特殊的限制，例如，可以將含有該物質作為有效成分的化妝品適用于需要恢復皮膚屏障功能的皮膚上，或者也可以將含有該物質的面膜或薄片搭載或貼在皮膚上。可以考慮皮膚的癥狀適當地確定上述物質適用的量。進而，該方法不限于直接適用于皮膚的方法，也可以經口給藥活化胱天蛋白酶-14的物質。下文列舉具體實例，更詳細地說明本發明。但是，本發明不限于此。實施例I、分析與胱天蛋白酶(caspase) ~14相互作用的因子
方法使胱天蛋白酶(caspase)_14與固定了抗胱天蛋白酶(caspase)_14抗體的瓊脂糖珠子結合，與下述人正常表皮細胞(NHEK)提取液反應，所述人正常表皮細胞是在增殖期和融合之后，暴露在空氣中，添加2mM鈣后繼續培養誘導分化后的細胞。用PBS洗滌后，用甘氨酸-HCl緩沖液(pH2. 3)洗脫結合蛋白。此外，使固定了抗胱天蛋白酶-14抗體的瓊脂糖珠子與正常表皮角質層提取液和從牛皮癬患者提取的皮屑提取液反應，用PBS洗滌后，同樣的用甘氨酸-HCl緩沖液(pH2. 3)洗脫結合蛋白。對這4種樣品施加LC/MS/MS分析。LC/MS/MS 分析為了將填充劑保持在內徑ΙΟΟμπκ長度120mm的未填充的毛細管柱(NewObjetive公司生產)的錐狀出口側的端部，制做了用二氧化硅制的玻璃料。在所得的毛細管柱中，填充平均粒徑為5 μ m的十八燒基化的二氧化娃型填充劑Aqua C18 (Phenomenex公司生產)至高度為100mm，獲得用于分析的反向毛細管柱。為了將填充劑保持在內徑250 μ m、長度150mm的未填充的毛細管柱(Agilent公司生產)的出口側的端部，制做了用二氧化硅制的玻璃料。在所得的毛細管柱的出口側，按2:1的質量比混合平均粒徑為5 μ m的陽離子交換樹脂型填充劑Partisphere SCX樹脂(Whatman公司生產)和平均粒徑為5 μ m的陰離子交換樹脂型填充劑PolyWAX LP (PolyLC公司生產)，在入口側填充平均粒徑為5μπι的十八烷基化的二氧化硅型填充劑Aqua C18(Phenomenex公司生產)。分別加至25mm高度，獲得由捕獲用的反向毛細管柱和SCX-WAX混合毛細管柱組成的二相毛細管柱。此外，在制備用于分析的反向毛細管柱和二相毛細管柱時，使用高壓氮氣和加壓型填充容器，通過填漿法來填充填充劑。之后，通過6步的MudPIT型分析(二維HPLC/ESI MS/MS)，分析上述4個樣品。首先，將含約4 μ g肽的上清液，通過加壓法上樣到二相毛細管柱中之后，使用樣品溶液10倍以上體積的移動相A(水、乙腈和蟻酸的體積比為95:5:0. I的混合液；ρ!Γ2. 6)，洗漆，脫鹽。將該二相毛細管柱10通過貫穿孔型接頭(Upchurch Scientif ic公司生產)(圖中未顯示)連接到用于分析的反向毛細管柱20上。然后，連接到使用內徑100 μ m的毛細管作為配管的Nanospace SI-2型HPLC裝置(資生堂公司生產)上。此時，在SCX-WAX混合毛細管柱12和用于分析的反向毛細管柱20的上游側配置有用于捕獲的反向毛細管柱11。使用移動相A、移動相B(水、乙腈和蟻酸的體積比為20:80:0. I的混合液)、移動相C (含有500mM醋酸銨的移動相A;pH 6_8)作為移動相，肽的洗脫方法為在每一步中逐步矩形地增加添加的移動相C的體積％，共計6步的梯度洗脫法。步驟I的洗脫方案是流過5分鐘的移動相A，之后5分鐘將移動相B的比例從O體積％增加至15體積％，之后60分鐘將移動相B的比例增加至45體積％，之后10分鐘將移動相B的比例增加至75體積％，之后以該比例流過5分鐘。步驟2-6的洗脫方案是流過I分鐘的移動相A，之后4分鐘流過比例為X(體積％)的移動相C，之后5分鐘將移動相C的比例從O體積％增加至15體積％，之后60分鐘將移動相C的比例增加至45體積％，之后10分鐘將移動相C的比例增加至75體積％，之后按該 比例流過5分鐘。此時，泵送液的流速為250 μ L/分鐘，通過阻抗型毛細管分流，柱的流速調整為30(T400nL/分鐘。此外，在測定ESI MS/MS時，使用離子講型質譜儀LCQ-Deca (Thermo FisherScientific公司生產)。此時，將從用于分析的反向毛細管柱中洗脫出的肽，不經過分流，直接導入質譜儀中。另外，在各個步驟中反復進行質量電荷比(m/z)為40(Tl400的全掃描MS頻譜測量I次，以及數據依賴型MS/MS頻譜測量3次。此時，標準解離能為35%。此外，MS頻譜測量和MS/MS測量都進行3次微掃描。此外，動態排除設定為重復計數1，重復周期O. 5分鐘，排除列表大小25，排除周期10. 00分鐘。所獲得的MS/MS 頻譜,通過在 Bioworks 軟件(Thermo Fisher Scientific 公司生產)上運行的SEQUEST算法,檢索非冗余的人數據庫(ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/db/FASTA/nr. gz,2007/2/8 版)。分析的結果僅在與誘導分化后的NHEK反應的樣品，以及與正常表皮角質層提取液反應后的樣品中一樣，都確定了存在鞘脂激活蛋白原。2、胱天蛋白酶(caspase)-14對鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的加工在通常的角質細胞單層培養體系中，鞘脂激活蛋白原沒有接受加工，僅以前體形式存在。利用這一點，研究前體鞘脂激活蛋白原與胱天蛋白酶-14的反應。在有或無1.2M親液鹽(檸檬酸離子)的條件下，使含有鞘脂激活蛋白原的人正常表皮細胞(NHEK)提取液與活化的胱天蛋白酶-14在37°C反應I小時，用水透析后，冷凍干燥。將其溶解在SDS電泳樣品緩沖液中，在SDS電泳后，通過蛋白質印跡，研究各自的鞘脂激活蛋白的生成。分別使用的抗體是抗鞘脂激活蛋白原抗體(PSAP多克隆抗體(AOl)=Abnova公司)、抗鞘脂激活蛋白A特異性抗體(本公司生產)、抗鞘脂激活蛋白B抗體(E-15, sc-27014 Santa Cruz公司)、抗鞘脂激活蛋白C抗體(H-81，sc-32875 =Santa Cruz公司)、抗鞘脂激活蛋白D抗體(E-14，sc-27024R =Santa Cruz公司)。稀釋比例都使用1/1000。此外，除了抗鞘脂激活蛋白A特異性抗體外，任一種抗體都識別鞘脂激活蛋白原。結果顯示在圖I中。根據圖I的結果可見，在存在胱天蛋白酶-14的條件下，鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解為多個中間體。其中，作為鞘脂激活蛋白原的最終分解產物之一的鞘脂激活蛋白A是通過鞘脂激活蛋白A特異性抗體識別出的，因此認為胱天蛋白酶-14實現了將鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A的效果。
3、免疫染色為了使用整形外科手術所獲得的正常皮膚切片，明確鞘脂激活蛋白原和鞘脂激活蛋白A的局部分布，進行了免疫染色。通過二甲苯將石蠟切片脫石蠟，放回PBS溶液后，通過10%山羊血清進行封閉。PBS洗滌后，與抗鞘脂激活蛋白原抗體(PSAP多克隆抗體(A01):Abnova公司，稀釋比例1/200)或抗鞘脂激活蛋白A特異性抗體(本公司生產)(稀釋比例1/200)在室溫下反應I小時。用PBS洗滌3次后，與Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(鞘脂激活蛋白原)或Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG (鞘脂激活蛋白A)在室溫下反應I小時。用 PBS 洗漆 3 次后，使用 VectorShield 封固劑(DAPI) (Vector Laboratories 公司)封固，通過熒光顯微鏡進行觀察。結果顯示在圖2中。
根據圖2的結果可見，鞘脂激活蛋白原在正常的人表皮基底層至顆粒層中存在，而鞘脂激活蛋白A在顆粒層的最上層表達。這一結果與上述蛋白質印跡的結果同時證明專門在角質細胞中表達的胱天蛋白酶在分解人皮膚中的鞘脂激活蛋白原，在皮膚屏障功能中發揮重要的作用。
權利要求
1.篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法，該方法包括在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原的步驟，和 與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A時，選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。
2.如權利要求I所述的方法，通過使用抗鞘脂激活蛋白A抗體的蛋白質印跡方法評估上述分解。
3.用于促進皮膚屏障功能恢復的方法，所述方法包括活化胱天蛋白酶-14，促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A。
4.如權利要求3所述的方法，包括將活化胱天蛋白酶-14的物質用于皮膚上。
全文摘要
本發明提供了篩選促進皮膚屏障功能恢復的物質的方法，該方法包括在存在促進皮膚屏障功能恢復的物質的候選物的情況下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原的步驟，和與對照物質相比，顯著促進鞘脂激活蛋白原分解為鞘脂激活蛋白A時，選擇該候選化合物為促進皮膚屏障功能恢復的物質的步驟。
文檔編號G01N33/53GK102906274SQ20108005488
公開日2013年1月30日 申請日期2010年12月3日 優先權日2009年12月4日
發明者日比野利彥, 山本真實 申請人:株式會社資生堂