一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法

專利名稱：一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法。
背景技術：
根際微生物(rhizosphere microbe)是在植物根系直接影響的土壤范圍內生長繁殖的微生物，其種類有細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物等，一般數量比根際外多幾倍至幾十倍。它們和植物間是互生關系，與植物根系相互作用、相互促進。根據植物根系與根際微生物共存形式又分為多種形式，最常見的如豆科植物與相應的根瘤細菌、外生菌根、內生菌根以及病原菌復合體等。
近年來，隨著宏基因組學與分子生態技術迅速發展，微生物熒光原位雜交 (fluore·scence in situ hybridization,FISH)結合的顯微鏡觀測成為了解根際微生物的有力工具。熒光原位雜交是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術。它以熒光染料標記的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作為探針，按照兩個核酸的堿基序列互補原則，將熒光素標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上(也可使用生物素標記的探針，再加入標記有熒光素的生物素單抗)，通過熒光檢測系統和圖形分析技術對染色體或DNA纖維上的DNA序列進行定位、定性和相對定量分析，實現原位樣品中的目標細菌的探測。
熒光原位雜交技術已經開始應用于植物根際微生物的觀察，但是目前普遍存在一些難點問題，主要集中在兩個方面。第一個方面也是最大的一個難點是植物根系本身通常具有較強的自發熒光。植物樣本采集后的最初24小時之內是觀測的最佳時機，之后由于植物本身逐漸加強的自發熒光現象嚴重干擾了微生物的觀測，但現實操作中很難保證采集植物樣本后能夠及時進行檢測。第二個方面是根際微生物稀疏的分布使得顯微鏡觀測過程中難以尋找到目的微生物，并且隨著時間的推移，根系本身逐漸加強的自發熒光現象使觀測更加困難。這兩個難點為植物根際微生物FISH觀測的瓶頸。發明內容
本發明的目的是提供一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法。
本發明提供的用于檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法，包括如下步驟
(I)植物根系片段的固定；
(2)熒光原位雜交；
其特征在于所述步驟(I)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟 (I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液進行處理，然后棄去所述植物根系片段。
所述步驟甲中的處理條件可為20-30°C、15-60分鐘。所述步驟甲中的處理條件具體可為22°C、20分鐘。所述步驟甲中，所述焦磷酸四鈉水溶液的濃度具體可為0. OOlmol/ L0
所述方法還可包括如下步驟乙將完成所述步驟甲的溶液體系(反應習題)離心收集沉淀，用PBS緩沖液沖洗并懸浮。所述PBS緩沖液具體可為pH = 7. 4、IOmmol的PBS 緩沖液。每株植物的根系片段完成所述步驟甲的溶液體系得到的沉淀優選采用2-5ml所述 PBS緩沖液進行所述懸浮。所述兩步驟乙中的所述離心的條件具體可為16000g，30秒。
所述步驟(I)具體可為將所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小時；所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份3XPBS緩沖液混合得到的；所述固定液的pH為7.0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。所述固定液的配制方法具體如下(以IOOml體積為例) (I)取66ml超純水在水浴中加熱至600C ； (2)加入4g多聚甲醛；(3)加入2mol/L的NaOH 水溶液至多聚甲醛充分溶解；⑷用3XPBS緩沖液補足至IOOml ； (5)室溫下放置冷卻，用 lmol/L的HCl水溶液調節pH至7. 0-7. 4; (6)用注射器通過濾頭(O. 22 μ m)過濾。所述 3XPBS緩沖液具體可為pH = 7. 4、30mmol的PBS緩沖液。
所述突光原位雜交的條件具體可為46°C雜交1. 5小時。
所述熒光原位雜交所用的探針上具有熒光素標記。所述熒光素具體可為FLUOS熒光素。所述熒光原位雜交所用的探針的核苷酸序列具體可如序列表的序列I所示。所述熒光素可位于所述探針的5’端或3’端。在所述熒光原位雜交中，所述探針的濃度優選為8.3pmol/ μ I或5pmol/μ I。所述植物根際微生物具體可為真細菌。
所述植物具體可為燈芯草(Juncus acutiflorus)。本發明提供的方法具體可包括如下步驟
①將植物的根系組織切割成1. 5-2. 5cm(2cm左右)長度的根系片段；
②將所述根系片段浸泡于所述溶液甲(以足夠將所述根系片段完全淹沒為準，2-5ml均可)中進行10-15小時(如12小時)的固定；
③將步驟②的反應體系離心(具體可為16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS 緩沖液沖洗兩次，然后用所述焦磷酸四鈉水溶液(以足夠將所述根系片段完全淹沒為準，5-10ml均可)懸浮，在22°C水浴中培養20分鐘(為使作用完全每5分鐘漩渦振蕩一次，每次振蕩約10-20秒);
④將步驟③的反應體系中的植物根系取出后離心(如16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS緩沖液沖洗兩次，然后用所述PBS緩沖液(以足夠將所述根系片段完全淹沒為準,2-5ml均可)懸浮；
⑤將10 μ I步驟④得到的懸浮液滴加至載玻片上，使其干燥(可用氮氣吹干，也可在空氣中自然風干)；
⑥將步驟⑤得到的載玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分鐘；
⑦將10μ I雜交緩沖液滴至載玻片的樣品上，加入1μ I所述探針并與雜交緩沖液混合均勻，46°C雜交1. 5小時；
⑧用淋洗緩沖液沖洗掉載玻片上的雜交緩沖液，然后將載玻片浸泡于所述淋洗緩沖液中，48°C水浴靜置20分鐘；用蒸餾水沖洗后使其干燥(可放置于46°C烘箱中進行干燥，也可利用氣體吹干)；
⑨進行DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察。
所述雜交緩沖液的制備方法具體可為將180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混勻，并用milliQ超純水定容至I毫升。所述雜交緩沖液由水和如下濃度的各個溶質組成=NaCl O. 9M、SDS O. 02g/100ml、甲酰胺30% (體積比)。
所述淋洗緩沖液的制備方法具體可為將Iml Tris-HCl緩沖液(1M、pH = 8. O)、 1020 μ I 5Μ NaCl 水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA 水溶液(pH = 8. O)混勻，并用 milliQ 超純水補足至50ml。所述淋洗緩沖液由水和如下濃度的各個溶質組成=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA0
所述DAPI染色時,可以加入抗粹滅劑。所述抗淬滅劑具體可為Vectorshield。
本發明提供的方法可以對采集后的樣本進行即時檢測，也可以允許采集后將樣本放置保存一定時間后再進行檢測，特別是對于放置24小時以上的樣本，避免了自發熒光， 具有突出良好的效果。
本發明的發明人經過長期的實驗研究，發現焦磷酸四鈉水溶液可達到使植物根系與表面微生物發生解離的現象。在此基礎上，對現有FISH方法進行改進，在現有FISH方法的固定與熒光原位雜交兩個步驟之間，增加了焦磷酸四鈉水溶液處理的步驟。本發明中的技術方案為將簡單清洗去除土壤及沉積物顆粒之后的植物根系片段進行固定；用焦磷酸四鈉水溶液處理固定之后的樣品，通過焦磷酸四鈉對根際微生物與其附著物(根系或土壤、沉積物顆粒)的解離作用，達到將二者分離的效果，去除原有附著物后，對包含解離脫落的微生物的所余溶液進行離心與再懸浮；繼續進行接下來的熒光原位雜交。本發明解決了植物根系FISH觀測中植物本身常發生的自發熒光現象和根系本身附著根際微生物含量較小不便于觀測的難點問題。


圖1為實施例1中的FISH結果圖；橫線代表10微米，圓圈內為目標微生物。
圖2為實施例2中的FISH結果圖；橫線代表10微米，圓圈內為目標微生物。
圖3為實施例3中的FISH結果圖；橫線代表10微米，圓圈內為目標微生物。
圖4為對比例中的FISH結果圖；圓圈內為目標微生物。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
實施例中所用的PBS緩沖液為pH = 7. 4U0mmol的PBS緩沖液；該PBS緩沖液 (pH = 7. 4)由溶質和水組成，溶質及其濃度如下=NaCl 137mmol · L-1，Na2HPO4IOmmol · L-1， KH2PO41. 76 · mmol. L、
實施例中所用的3XPBS緩沖液為pH = 7. 4、30mmol的PBS緩沖液；該PBS緩沖液 (pH = 7. 4)由溶質和水組成，溶質同PBS緩沖液，各個溶質的濃度均為PBS緩沖液的三倍。
燈芯草(Juncus acutiflorus)為常見濕地植物，參考文獻成水平人工濕地廢水處理系統的生物學基礎研究進展湖泊科學，1996,8(3) =268-273.;吳建強，阮曉紅，王雪人工濕地中水生植物的作用和選擇水資源保護，2005，21 (I) :1-6。
實施例1、采用本發明的方法進行熒光原位雜交
1、自濕地中取一株燈芯草(Juncus acutiflorus)的根系組織,取樣48小時后,用去離子水清洗去除表面附著的過多濕地沉積物與土壤殘余；然后將根系組織切割成2cm左右長度的根系片段。
2、將步驟I獲得的根系片段浸泡于2_5ml (足夠將根系片段完全淹沒為準)溶液甲中進行12小時的固定。
所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份PBS緩沖液混合得到的。
固定液的配制方法如下(以IOOml體積為例)(I)取66ml超純水在水浴中加熱至60°C;⑵加入4g多聚甲醛至水中，混合液會變渾濁；(3)緩緩加入2mol/L的NaOH水溶液至混合液中直至溶液清澈；(4)用3XPBS緩沖液補足至IOOml ； (5)室溫下放置冷卻，用 lmol/L的HCl水溶液調節pH至7. 0-7. 4 ； (6)用注射器通過濾頭(O. 22 μ m)過濾。
3、將步驟2的反應體系離心(16000g，30秒)，收集沉淀并用PBS緩沖液沖洗兩次， 然后用5-10ml (足夠將根系片段完全淹沒為準)O. OOlmol/L焦磷酸四鈉水溶液懸浮(為使作用完全可先漩渦振蕩I分鐘)，在22°C水浴中培養20分鐘(為使作用完全每5分鐘振蕩一次，每次振蕩約10-20秒)。
4、將步驟3的反應體系中的根系片段取出，剩余的反應體系(溶液體系)離心 (16000g, 30秒)，收集沉淀并用PBS緩沖液沖洗兩次，然后用2-5ml (足夠將根系片段完全淹沒為準)PBS緩沖液懸浮。
實際應用時，可以根據實際需要確定本步驟中最后加入的PBS緩沖液體積，小量的PBS緩沖液可起到富集作用。本步驟得到的樣本如需長期保存可保存于100%乙醇和PBS 緩沖液等體積混合得到的混合液中，_20°C保存。
5、將10 μ I步驟4得到的懸浮液滴加至載玻片上，用氮氣吹干(也可在空氣中自然風干)。
實際應用時，如果樣品顆粒較大可使用0.1 %瓊脂糖膠點在樣品上后干燥，起到固定作用。
6、將步驟5得到的載玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分鐘。
實際應用中，本步驟處理后可將樣品可以儲藏于_20°C條件下。
7、將10μ I雜交緩沖液滴至載玻片的樣品上，加入1μ I雜交探針，用移液器槍頭輕輕攪動用以混合；46°C雜交1. 5小時。
本實施例中所用的雜交探針為針對真細菌的EUB338探針，核苷酸序列為(序列表的序列I) :5’ -GCTGCCTCCCGTSGGAGT-3’(5’末端標記FLUOS熒光素)，雜交探針濃度為 8.3pmol/μ I。
實施例中所用的雜交緩沖液的制備方法將180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混勻，并用milliQ超純水定容至I毫升。 雜交緩沖液中各溶質的濃度如下=NaCl 0.9M、SDS 0. 02g/100ml、甲酰胺30% (體積比)。
實際應用中，應根據具體的探針選擇合適的雜交緩沖液。實際應用中，如果采用 Cy3或者Cy5標記的雜交探針，雜交探針濃度最好為5pmol/ μ I。
8、用少量淋洗緩沖液沖洗掉載玻片上的雜交緩沖液，然后將載玻片浸泡于淋洗緩沖液中，48°C水浴靜置20分鐘；將載玻片表面的淋洗緩沖液用預冷卻的蒸餾水沖洗掉，放置于46°C烘箱中進行干燥(也可利用氣體吹干)。
實施例中所用的淋洗緩沖液的制備方法將Iml Tris-HCl緩沖液(1Μ、ρΗ = 8.0),1020 μ I5M NaCl水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA水溶液(pH = 8. O)混勻，并用milliQ超純水補足至50mlO淋洗緩沖液中各溶質的濃度如下=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA。
實際應用中，應根據具體的探針選擇合適的淋洗緩沖液。
9、將預混有DAPI染料的Vectorshield(抗淬滅劑)滴加至載玻片的樣本上，蓋上蓋玻片，用突光顯微鏡(Zeiss Axioplan 2microscope ；Zeiss, Jena, Germany)觀察。
見圖1。可以清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
實施例2、采用本發明的方法進行熒光原位雜交
1、同實施例1的步驟I。
2、同實施例1的步驟2。
3、采用O. 0001mol/L焦磷酸四鈉水溶液，在20°C水浴中培養15分鐘，其它同實施例I的步驟3。
4、同實施例1的步驟4。
5、同實施例1的步驟5。
6、同實施例1的步驟6。
7、同實施例1的步驟7。
8、同實施例1的步驟8。
9、同實施例1的步驟9。
見圖2。可以清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
實施例3、采用本發明的方法進行熒光原位雜交
1、同實施例1的步驟I。
2、同實施例1的步驟2。
3、采用0. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液，在30°C水浴中培養60分鐘，其它同實施例1的步驟3。
4、同實施例1的步驟4。
5、同實施例1的步驟5。
6、同實施例1的步驟6。
7、同實施例1的步驟7。
8、同實施例1的步驟8。
9、同實施例1的步驟9。
見圖3。可以清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
對比例、采用現有方法(無焦磷酸四鈉水溶液解離處理)進行熒光原位雜交
1、同實施例1的步驟I。
2、同實施例1的步驟2。
3、將步驟2的反應體系(含根系片段)滴加至載玻片上，用氮氣吹干。
4、同實施例1的步驟6。
5、同實施例1的步驟7。
6、同實施例1的步驟8。
7、同實施例1的步驟9。
見圖4。根系顯示很強的自發英冠，不能清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
序列表〈110〉中國科學院生態環境研究中心〈120〉一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法<130> CGGNAY1120856〈160〉 I〈210〉 I<211〉18 〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉 <223>〈400〉 Igctgcctccc gtsggagt18
權利要求
1.一種用于檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法，包括如下步驟(1)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于所述步驟(I)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟(I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液進行處理，然后棄去所述植物根系片段。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟甲中的處理條件為20-30°C、 15-60分鐘。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟甲中的處理條件為22°C、20分鐘； 所述焦磷酸四鈉水溶液的濃度為O. 001mol/L。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟乙將完成所述步驟甲的溶液體系離心收集沉淀，用PBS緩沖液沖洗并懸浮。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(I)為將所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小時；所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份3XPBS緩沖液混合得到的；所述固定液的PH為7. 0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。
6.如權利要求1至5中任一所述的方法,其特征在于所述突光原位雜交的條件為 46°C雜交1. 5小時。
7.如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述熒光原位雜交所用的探針上具有熒光素標記；所述熒光素優選為FLUOS熒光素。
8.如權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述熒光原位雜交所用的探針的核苷酸序列如序列表的序列I所示。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述熒光原位雜交所用的探針的濃度為 8.3pmol/μ I。
10.如權利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為燈芯草。
全文摘要
本發明公開了一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法。本發明提供的方法，包括如下步驟(1)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于所述步驟(1)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟(1)的植物根系片段用0.0001至0.1mol/L焦磷酸四鈉水溶液進行處理。本發明的發明人發現焦磷酸四鈉水溶液可達到使植物根系與表面微生物發生解離的現象。在此基礎上，對現有FISH方法進行改進，在現有FISH方法的固定與熒光原位雜交兩個步驟之間，增加了焦磷酸四鈉水溶液處理的步驟。本發明解決了植物根系FISH觀測中植物本身常發生的自發熒光現象和根系本身附著根際微生物含量較小不便于觀測的難點問題。
文檔編號G01N21/64GK102994614SQ20111026685
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月9日 優先權日2011年9月9日
發明者祝貴兵, 王雨, 尹澄清 申請人:中國科學院生態環境研究中心