專利名稱：一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法
技術領域：
本發明涉及生態環境保護領域，主要涉及一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法。
背景技術：
轉基因作物的研制與應用是提高我國農業生產效率、有效解決我國的糧食安全問題的重要途徑。轉基因作物的釋放與規模生產對農業生態環境可能產生一定的影響，客觀評價轉基因作物對農業生態環境的可能影響是轉基因作物研究和發展的重要基礎和現實問題。土壤是農業生產的載體，轉基因作物種植與土壤生態系統間將發生一系列交互作用，轉基因作物的外源基因及其表達產物可通過多種途徑進入土壤生態系統，其中最直接的途徑有1)根系分泌物轉基因作物根系表達的毒素蛋白和根系分泌物不斷地向作物根際周圍土壤釋放外源基因及其表達產物；2)作物殘茬轉基因作物的外源基因及其表達產物可通過收割前后遺留在田間的根茬和殘枝落葉等進入土壤；3)轉基因作物花粉的散布使外源基因逃逸并進入土壤。轉基因作物的外源基因及其表達產物進入土壤，與土壤微生物接觸，對其產生不同程度的影響。研究表明轉基因作物種植會對某些特定的微生物發生影響，如抗草甘膦大豆的種植會促進大豆根腐鐮刀菌(Fusarium spp.)的生長和定殖，使該轉基因大豆品種的應用受到一定的制約。轉Bt基因水稻(克螟稻)秸稈還田對水田土壤反硝化細菌和產甲烷細菌種群有顯著的抑制作用，對厭氧發酵細菌種群有顯著的刺激作用，對厭氧固氮細菌種群有輕微刺激作用。特定微生物的改變將反映在土壤微生物結構和功能上的變化，如，轉基因油菜根際微生物組成的差異導致轉和非轉基因油菜品種根際微生物在碳素利用方式和脂肪酸甲基酯圖譜方面明顯不同。已知多種作物的多個轉基因品系及其殘體可以改變土壤微生物群體的組成，但這些改變也同時受檢測技術、田間土壤性狀、季節變化等的影響。因此，準確檢測轉基因種植土壤微生物變化是評估轉基因作物釋放生態風險的重要基礎。
發明內容
本發明提供了一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法，為轉基因水稻對土壤生態系統安全評估提供技術手段。一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法，包括(1)分別采集轉基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30°C下風干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴增所述微生物的 16SrDNAV3片段，擴增產物經溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；(3)對各生長階段轉基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進行分析，得到轉基因水稻根際土壤微生物的結構變化情況。 所述的溫度梯度凝膠電泳采用的凝膠溶液為放置30天后的聚丙烯酰胺凝膠溶液。所述的溫度梯度凝膠電泳的條件為電壓160-200V、溫度42-50°C，電泳時間 3-4h。所述的提取混合液中微生物的總DNA的方法為采用FastPr印核酸提取儀和 FastDNA SPIN Kit for soil 試劑盒提取。所述PCR擴增所采用的正向引物和反向引物的堿基序列分別如SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO 2 所示。本發明檢測方法操作簡便，TGGE圖譜條帶豐富，檢測的土壤細菌完整性強，且有效克服了土壤腐殖質的干擾，能夠對轉基因水稻根際土壤微生物結構變化做出準確測定。
圖1為華池B6、嘉早935、中九B種植期間不同生長期的土壤樣品16S rDNA V3區 TGGE指紋圖譜，其中，1-3泳道為華池B6，4-6泳道為嘉早935，7_9用到為中九B ；A分蘗期， B抽穗期，C灌漿期，D成熟期；圖2為華池B6、嘉早935、中九B第一年種植期間不同生長期的土壤樣品16S rDNAV3區TGGE指紋圖譜主成分分析圖，其中A分蘗期，B抽穗期，C灌漿期，D成熟期。
具體實施例方式水稻材料Bt水稻華池B6、親本嘉早935和遠緣親本中九B田間試驗與采樣田間實驗在浙江省建德市苗木基地進行，試驗田劃分為9個小區，分別種植這三個水稻品種，每個品種均設3個重復小區，每個小區26-28行X 12株/行> 300株，不同品種的小區間隔設置。在水稻的分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期分別取樣。將水稻連同其根部的泥土用小鏟一起拔出并帶回實驗室，每個小區取三株水稻樣品。取回的樣品在室溫下適度風干后， 抖落并收集根際周圍的土壤，在除去植物殘根和石礫等雜物后，過2mm篩后備用。土壤總DNA的提取土壤總DNA的提取采用FastPr印核酸提取儀和FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒(Qbiogene，Carlsbad，CA，USA)進行提取，提取的土壤總DNA用的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。土壤中DNA提取的步驟按照試劑盒上的要求進行，具體步驟如下(1)稱取0. 5g 土樣加入到裂解E管中；(2)分別加入978 μ 1磷酸鹽緩沖液(ρΗ 8. 0)和122 μ 1 MT緩沖液；(3)將裂解E管置于FastPr印FP120核酸提取儀中，振蕩速度為6. 0m/s，細胞裂解40s ； (4) 14000 Xg離心IOmin ； (5)轉移上清液到干凈的離心管中，加入250 μ 1PPS，用手上下搖晃數次，使其充分混勻；(6) 14000 X g離心5min，轉移上清液至2ml離心管中，加入Iml結合基體混合液；(7)旋渦振蕩5min以使結合基體與DNA充分結合，混合好后靜置3min ； (8)棄 500 μ 1上清液，將剩余的上清液和結合基體充分混勻后取680 μ 1到過濾管中，14000 X g離心lmin，棄上清液并將剩余的混合液混勻后加入到過濾管中，再14000 Xg離心Imin并將上清液倒去；(9)加入500 μ 1 SEMS-M至過濾管中，14000 Xg離心lmin，棄濾液，把過濾管重新放入收集管中，14000 Xg離心Imin去除剩余的SEMS-M洗滌液；(10)把過濾管放入新的收集管中，于室溫下干燥5min; (11)加50 μ 1 DES與過濾管中，旋渦使其充分混合，14000Xg 離心lmin，將DNA洗脫至收集管中，-20°C冰箱中保存。土壤微生物16S rDNA擴增土壤微生物 16S rDNA 進行 PCR 擴增的引物 Primer 1 (341f_GC)、Primer2 (534r) 由上海生工生物技術服務公司合成，其序列見表1，主要用于擴增16rDNA V3區段。PCR 反應體系為 51 μ 1 :DNA 模板(基因組)0. 5 μ 1 ；dNTP (10 μ M) 1. 5 μ 1 ； MgCl2 (25mM) 3.0μ 1 ；IOX buffer 5. 0 μ 1 ；Primer 1 (10 μ Μ) 1. 0 μ 1 ；Primer 2 (10 μ Μ) 1· 0 μ 1 ；Taq 酶(5U/ μ 1)0. 15 μ 1 ；ddH20 38. 75 μ 1。PCR 反應條件為95°C變性 5min，94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 45s，共 30 個循環，最后在72°C延伸lOmin。反應結束后取ΙΟμΙ PCR擴增產物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。電泳條件為120V (恒壓)，25min。表IPCR擴增的引物
權利要求
1.一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法，包括(1)分別采集轉基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30°C下風干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴增所述微生物的 16SrDNAV3片段，擴增產物經溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；(3)對各生長階段轉基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進行分析，得到轉基因水稻根際土壤微生物的結構變化情況。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的溫度梯度凝膠電泳采用的凝膠溶液為放置30天后的聚丙烯酰胺凝膠溶液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的溫度梯度凝膠電泳的溫度范圍為 42 50°C。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增所采用的正向引物和反向引物的堿基序列分別如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
全文摘要
本發明公開了一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法，包括(1)分別采集轉基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30℃下風干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴增所述微生物的16SrDNA V3片段，擴增產物經溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；(3)對各生長階段轉基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進行分析，得到轉基因水稻根際土壤微生物的結構變化情況。本發明檢測方法操作簡便，有效克服了土壤腐殖質的干擾，能夠對轉基因水稻根際土壤微生物結構變化做出準確測定。
文檔編號C12Q1/68GK102344968SQ20111036248
公開日2012年2月8日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者董斌, 虞云龍 申請人:浙江大學