專利名稱：一種檢測利瑪原甲藻的方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，具體為檢測利瑪原甲藻的方法。
背景技術：
現階段，我國對有害藻類的認識多側重在浮游藻類，而對底棲藻類的研究工作還處于起始階段，這就使得在過去的近岸海域生態調查時對底棲藻類鮮有記錄。但是，隨著我國有毒有害赤潮頻發，使得水產品品質受到損害，食品安全問題成為人們首要關心的問題。 由于便于培養及所分泌的毒素易制作成標準品，產毒底棲甲藻利瑪原甲藻成為研究人員研究產毒藻類的重點內容。利瑪原甲藻常附生于大型海藻、海草、底層沉積物表面，以及珊瑚礁或紅樹林區域的浮砂碎石上，有著不同于浮游藻類的生態習性。它呈世界性分布，在我國南海海域也有報道。王朝暉等曾于1997年秋至1998年春對廣東沿海多次赤潮進行研究時，在珠海附近的米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)赤潮發生區域的底層水樣中檢測出大量利瑪原甲藻，濃度約為800Cells/L。利瑪原甲藻能夠產生包括OA(Okadaic Acid) 和 DTX-I (Dinophysistoxin-I)等在內的多種腹瀉性貝類毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP)。腹瀉性貝類毒素一般以貝類作為載體，被濾食后在貝類體內富集， 再通過食物鏈傳遞被人類或動物吸收，直接威脅到人類及動物的健康，甚至生命。相關實驗證實，它能致使腸黏膜損傷，在一定程度上促進腫瘤并發。腹瀉性貝類毒素同西加魚毒(Ciguatera Fish Poisoning，CFP)、神經毒性貝類毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning,NSP)等一樣，屬于聚酮類化合物。這類化合物結構復雜，構型變化較多，主要由聚酮合酶(Polyketide Synthetase,PKS)催化形成。研究發現聚酮合酶以三種基本類型出現，而第一類型(Type I )為多功能酶，由單一蛋白基團及其周圍功能區域構成，是目前研究最為深入的類型。但它是否存在于甲藻中還有爭議，但依據對聚酮合酶基因的研究來看， 其在一些產DSP毒素的甲藻中被陸續發現，并證實在甲藻體外共生菌體內不存在。本發明是在此基礎上，篩選利瑪原甲藻中存在的聚酮合酶基因，克隆及測序后，設計特異引物及探針，并連同針對其rDNA ITS(ITSl-5. 8S rRNA_ITS2)序列設計的特異引物和探針，初步建立雙TaqMan探針實時熒光定量PCR快速檢測方法檢測利瑪原甲藻。TaqMan探針實時熒光定量PCR技術與常規PCR技術相比存在許多優勢，它無需借助凝膠電泳或銀染獲取檢測結果， 可直接通過光電傳導系統探測PCR擴增過程中熒光信號的變化得以知曉檢測結果；而且， 它較雙鏈DNA內嵌染料(如STOR green)定量PCR技術無法區分特異性和非特異性產物而言，TaqMan探針具有很高的特異性、信噪比，且可以進行多重檢測。正是因為以上特點，它已被研究人員用于部分有害藻類的檢測中。本發明也是借助該技術，期望以此可以提高對產毒底棲甲藻的實際檢測效率和精度，有助于進一步實施在海洋環境中的檢測，也為建立早期赤潮預警機制提供必要支持
發明內容
本發明旨在提供一種檢測利瑪原甲藻的方法，實現定量檢測。技術方案為針對利瑪原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列設計特異性引物和I1aqMan探針，利用實時(real-time)PCR方法熒光定量檢測。一種檢測利瑪原甲藻的方法，步驟包括(1)用CTAB改良法提取待測水樣中的利瑪原甲藻的基因組DNA ；(2)用特異性引物和特異性探針，擴增利瑪原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一種，采用熒光定量PCR檢測方法，對照標準曲線，確定待測水樣中瑪原甲藻含量；rDNA ITS基因序列的特異性引物為上游cttggaatggcgcaacaagc，下游 aaaccacaagacacgatgaaacg ；艮口 SEQ ID No. 1 禾口 No. 2 ；PKS基因序列的特異性引物為上游atccccagcaacgattattaatgg，下游 tgcgtgaaagcgaagagtcc ；艮口 SEQ ID No. 3 禾口 No. 4 ；rDNA ITS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列ccaaacctgccaccgttcctcgct ；艮口 SEQ ID No. 5 ；PKS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列cggctcgctccaacgcttcccaac ；艮口 SEQ ID No. 6。步驟⑵中PCR擴增的條件為94 96 °C條件下，預變性1. 5 2. 5min ；循環溫度，94. 5 95. 50C IOsec,59. 8 60. 5°C 30sec，35 40 次循環。優選的，PKS基因序列的TaqMan探針5’端使用報告染料FAM標記；ITS基因序列的I1aqMan探針5’端使用報告染料HEX標記；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探針 3’端用報告染料TAMRA標記。具體的，步驟O)中可以用單重熒光定量PCR檢測方法或者雙重熒光定量PCR檢測方法。雙重熒光定量PCR檢測方法是將PKS基因序列的特異性引物及TaqMan探針、ITS基因序列的特異性引物及TaqMan探針同時用于擴增和檢測模板DNA。單重熒光定量PCR檢測方法是將PKS基因序列的特異性引物及TaqMan探針、ITS基因序列的特異性引物及TaqMan 探針分別用于擴增和檢測模板DNA。標準曲線的測定構建方法包括以下步驟以對應不同濃度利瑪原甲藻的利瑪原甲藻基因組DNA為模板，分別加入相應基因序列的特異性引物和TaqMan探針擴增。本發明可用于底棲甲藻利瑪原甲藻的定量及赤潮快速預警等領域，克服現有技術中使用單一分子指標時帶來的檢測誤差，通過雙基因同時檢測以提高準確率。與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果采用TaqMan探針進行熒光定量 PCR檢測，針對rDNAITS序列設計的探針P-ITS的5’端使用報告染料FAM標記，針對PKS基因設計的探針P-PKS的5’端使用報告染料HEX標記，這兩個TaqMan探針的3’端都以報告染料TAMRA標記。較雙鏈DNA內嵌染料(如STORgreen)法無法區分特異性和非特異性產物而言，TaqMan探針具有很高的特異性、信噪比，且可以進行多重檢測；以多個基因作為分子指標，提高了檢測精度，操作簡便，易于掌握，可快速檢測出水體中的利瑪原甲藻。并且， rDNA ITS和PKS探針同時檢測水環境中的利瑪原甲藻時，最低可檢測到1個藻細胞，當它們分別進行檢測時，最低可檢測到0. 1個藻細胞。
圖1為rDNA ITS和PKS基因序列擴增產物凝膠電泳檢測圖譜(A和B分別為rDNA ITS和PKS基因常規PCR擴增的檢測結果；C為實施例2特異引物擴增PKS基因和rDNA ITS 的檢測結果)圖2為TaqMan實時熒光定量PCR的標準曲線。標準曲線以DNA模板對應的藻細胞數為橫坐標，以熒光定量PCR擴增曲線對應的CT值為縱坐標，ITS標準曲線方程為y =-3. 085x+36. 84，R2 = 0. 996 ；PKS 標準曲線方程為 y = -3. 075x+33. 59，R2 = 0. 998。圖3為雙重PCR測試中rDNA ITS基因的擴增曲線。圖中顯示模板DNA按1 1 1 IO4等五個稀釋梯度的擴增曲線，1 IO5稀釋組未獲得擴增結果。圖4為雙重PCR測試中I3KS基因的擴增曲線。圖中顯示模板DNA按1 1 1 IO3 等五個稀釋梯度的擴增曲線，1 IO4和1 IO5兩個稀釋組未獲得擴增結果。
具體實施例方式實施例1利瑪原甲藻DNA提取從培養瓶中取出適量利瑪原甲藻藻液，于顯微鏡下計數。離心收集2ml對數期藻液，采用CTAB改良法提取DNA 加入0. 7ml CTAB提取液，于65°C條件下溫育一小時，后加入0. 4ml酚氯仿 異戊醇(PCI，24 24 1)試劑抽提兩次，再加入0.32ml的異丙醇使之沉淀，并用0.5ml 70%乙醇洗滌后，晾干，加入40 μ L超純水，于_20°C環境中儲存。CTAB提取液的組分包括 3% (w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，1% (W/V)Sark0Syl(肌氨酰)，20mmol/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl，0. Imol/L Tris-HCl pH 8. 0,1 % (ν/ν) β-mercaptoethano ( β -巰基乙醇)。實施例2引物及I1aqMan探針的設計根據測序獲取的rDNAITS和基因信息(常規的擴增引物序列見表1，序列電泳圖見圖I-A和B)，篩選引物并擴增利瑪原甲藻的rDNA ITS和PKS基因，得到604bp和678bp 的序列，經過克隆后測序獲取基因信息。表1本實驗中用于常規PCR擴增ITS和PKS基因所用引物一覽
權利要求
1.一種檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用CTAB改良法提取待測水樣中的瑪原甲藻的基因組DNA；(2)用特異性引物和特異性探針，擴增利瑪原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一種，采用熒光定量PCR檢測方法，對照標準曲線，確定待測水樣中瑪原甲藻含量；ITS基因序列的特異性引物為上游cttggaatggcgcaacaagc，下游 aaaccacaagacacgatgaaacg ；PKS基因序列的特異性引物為上游atccccagcaacgattattaatgg，下游 tgcgtgaaagcgaagagtcc ；ITS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列ccaaacctgccaccgttcctcgct ；PKS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列cggctcgctccaacgcttcccaac0
2.權利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟( 中94 96°C條件下， 預變性 1. 5 2. 5min ；循環溫度，94. 5 95. 5°C IOsec,59. 8 60. 5°C 30sec,35 40 次循環。
3.權利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟O)中PKS基因序列的 TaqMan探針5’端使用報告染料FAM標記；ITS基因序列的TaqMan探針5’端使用報告染料 HEX標記；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探針3’端用報告染料TAMRA標記。
4.權利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟(2)中標準曲線的測定構建方法包括以下步驟以對應不同濃度利瑪原甲藻的利瑪原甲藻基因組DNA為模板，分別加入相應的基因序列的特異性引物和TaqMan探針擴增。
全文摘要
本發明涉及生物檢測領域，公開一種檢測利瑪原甲藻的方法。具體為，針對利瑪原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列設計特異性引物和TaqMan探針，利用實時(real-time)PCR方法熒光定量檢測。本方法可用于底棲甲藻利瑪原甲藻的定量及赤潮快速預警等領域，提高了檢測精度，操作簡便，易于掌握，可快速檢測出水體中的利瑪原甲藻。
文檔編號G01N21/64GK102433390SQ20121000513
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者何培民, 唐晨, 董麗, 賈睿, 饒濤 申請人:上海海洋大學