專利名稱：一種離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法
技術領域：
本發明屬于植物形態學領域，更具體地說，本發明涉及一種離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法。
背景技術：
在植物有性生殖過程中，花粉粘附在柱頭的表面是一個關鍵的步驟。長期以來，對授粉后花粉與柱頭之間的粘附力的研究是一個空白。現在還沒有一種成熟的測定授粉后花粉與柱頭之間的結合力的方法。但是，在實際的繁種過程中常常遇到 陰雨天，這種天氣常常被認為不適宜進行授粉操作。人們常常擔心雨水會將剛授粉的柱頭表面的花粉沖涮下來，造成授粉失敗。建立測定植物花粉與柱頭之間的粘附力的方法就是為了給在實際的繁種過程中提供一個可靠、準確的方法，為實際的授粉操作提供一個科學的依據。從而打消某些不利的授粉的天氣的疑惑。不僅如此，在實際的雜交授粉過程中，常常會用到某些介質花粉，而建立這種測定方法也可以更好的檢驗其對花粉與柱頭之間的粘附力是否有益？為今后開發更多更好的適用于不良天氣下的介質花粉的開發提供一個可靠、科學的檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種測量結果準確、重復性好、簡便易行的離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法。本發明的目的是這樣實現的(除非另有說明外，本發明所采用的百分數均為質量百分數)
一種離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，包括花粉密度測定、離心液配制、授粉柱頭固定、差速離心洗脫及熒光顯微鏡觀察、粘附力計算等工序，具體有以下步驟
A、花粉密度測定用密度梯度離心法測定花粉密度；
B、離心液配制將蔗糖溶于水中，配制成質量百分比70%的溶液作為離心液，置于微量離心管中備用；
C、授粉柱頭固定將待測柱頭切下l(Tl5mm長一段，授粉后，將授粉柱頭固定在盛有2/3體積離心液的微量離心管底部，靜置3 5min ；
D、差速離心洗脫及熒光顯微鏡觀察在Γ30 下，將經質量百分比O.0Γ1%的水溶性苯丙胺藍染色的授粉柱頭，在離心機中以不同的加速度gass，離心處理5 20min，用紫外熒光顯微鏡觀察柱頭表面花粉粒的附著情況，記錄柱頭表面觀察不到花粉粒狀態下的加速度
g加速度；
D、粘附力計算花粉與柱頭間的粘附力，按照下列公式計算
f. \ r J 1 g .Y:.隻:f -!*、-Ji- ' J -im Λ g %.眷舞(< d mm J 1 -a-1, n
其中
-測定溫度下鹿糖溶液的密度g/ml ；—花粉的密度g/ml ；
Via—花粉的體積ml ；
g加速度——花粉被離心洗脫時的重力加速度m/s2。本發明所述的離心法用于測定花粉與柱頭間的粘附力，具有以下優點
1、測量精度高；
2、重復性好；
3、簡便易行；
4、檢測快速。
圖I為本發明測定方法的流程框 圖2為質量百分比55%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度標準曲線；
圖3為質量百分比60%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度標準曲線；
圖4為質量百分比50%的蔗糖溶液中N. repanda花粉的吸光度標準曲線；
圖5為質量百分比55%的蔗糖溶液中N. repanda花粉的吸光度標準曲線；
圖6為質量百分比60%的蔗糖溶液中N. repanda花粉的吸光度標準曲線。
具體實施例方式下面結合附圖與實施例對本發明做進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護范圍。一種離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，包括花粉密度測定、離心液配制、授粉柱頭固定、差速離心洗脫及熒光顯微鏡觀察、粘附力計算等工序，具體有以下步驟
A、花粉密度測定用密度梯度離心法測定花粉密度；
B、離心液配制將蔗糖溶于水中，配制成質量百分比70%的溶液作為離心液，置于微量離心管中備用；
C、授粉柱頭固定將待測柱頭切下l(Tl5mm長一段，授粉后，將授粉柱頭固定在盛有2/3體積離心液的微量離心管底部，靜置3 5min ；
D、差速離心洗脫及熒光顯微鏡觀察在Γ30 下，將經質量百分比O.0Γ1%的水溶性苯丙胺藍染色的授粉柱頭，在離心機中以不同的加速度gass，離心處理5 20min，用紫外熒光顯微鏡觀察柱頭表面花粉粒的附著情況，記錄柱頭表面觀察不到花粉粒狀態下的加速度
g加速度；
E、粘附力計算花粉與柱頭間的粘附力，按照下列公式計算
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其中
-測定溫度下鹿糖溶液的密度g/ml ；
—花粉的密度g/ml ；
Via—花粉的體積ml ；
g加速度——花粉被離心洗脫時的重力加速度m/s2。
步驟A所述密度梯度離心法測定花粉密度，包括蔗糖濃度梯度溶液配制、花粉樣品處理、花粉樣品鋪放、密度梯度離心液配制、離心沉降、繪制吸光度標準曲線、測定吸光度及花粉密度計算，具體包括
a、蔗糖濃度梯度溶液配制將蔗糖溶于水中，配制成質量百分比分別為2(Γ70%的溶
液；
b、花粉樣品處理將蔗糖溶于水中，配置成質量百分比為10%的溶液，稱取O. 001 O. Olg待測花粉混合在100 1000 μ I 10%蔗糖溶液中；
C、花粉樣品鋪放將含有花粉樣品的10%蔗糖溶液注入離心管底部；
d、密度梯度離心液配制采用層鋪法將質量百分比2(Γ70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待測花粉樣品的10%蔗糖溶液的離心管底部，配置成密度梯度離心液；
e、離心沉降在離心機中，20°C下，以400(Tl0000rpm速度，對含待測花粉樣品的密度梯度離心液離心5 15min，待花粉達到沉降平衡后靜置；
f、繪制吸光度標準曲線選取花粉懸浮所在層相應濃度的蔗糖溶液，繪制待測花粉在該相應濃度的蔗糖溶液中的吸光度標準曲線；
g、測定吸光度值取花粉沉降平衡后的密度梯度離心液，采用分光光度計在290nm波長下，測定待測花粉懸浮層蔗糖溶液的吸光度值，利用標準曲線換算成該層濃度梯度下花粉的濃度值；
h :花粉密度計算花粉的密度按照下列公式計算
權利要求
1.一種離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，包括花粉密度測定、離心液配制、授粉柱頭固定、差速離心洗脫及熒光顯微鏡觀察、粘附力計算等工序，具體有以下步驟 A、花粉密度測定用密度梯度離心法測定花粉密度； B、離心液配制將蔗糖溶于水中，配制成質量百分比70%的溶液作為離心液，置于微量離心管中備用； C、授粉柱頭固定將待測柱頭切下1(Γ15_長的一段，授粉后，將授粉柱頭固定在盛有2/3體積離心液的微量離心管底部，靜置3 5min ； D、差速離心洗脫及熒光顯微鏡觀察在Γ30 下，將經質量百分比O.0Γ1%的水溶性苯丙胺藍染色的授粉柱頭，在離心機中以不同的加速度gass，離心處理5 20min，用紫外熒光顯微鏡觀察柱頭表面花粉粒的附著情況，記錄柱頭表面觀察不到花粉粒狀態下的加速度g加速度； D、粘附力計算花粉與柱頭間的粘附力，按照下列公式計算
2.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟A所述密度梯度離心法測定花粉密度，包括蔗糖濃度梯度溶液配制、花粉樣品處理、花粉樣品鋪放、密度梯度離心液配制、離心沉降、繪制吸光度標準曲線、測定吸光度及花粉密度計算，具體包括 a、蔗糖濃度梯度溶液配制將蔗糖溶于水中，配制成質量百分比分別為2(Γ70%的溶液； b、花粉樣品處理將蔗糖溶于水中，配置成質量百分比為10%的溶液，稱取O.001 O. Olg待測花粉混合在100 1000 μ I 10%蔗糖溶液中； C、花粉樣品鋪放將含有花粉樣品的10%蔗糖溶液注入離心管底部； d、密度梯度離心液配制采用層鋪法將質量百分比2(Γ70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待測花粉樣品的10%蔗糖溶液的離心管底部，配置成密度梯度離心液； e、離心沉降在離心機中20°C下以400(Tl0000rpm速度，對含待測花粉樣品的密度梯度離心液離心5 15min，待花粉達到沉降平衡后靜置； f、繪制吸光度標準曲線選取花粉懸浮所在層相應濃度的蔗糖溶液，繪制待測花粉在該相應濃度的蔗糖溶液中的吸光度標準曲線； g、測定吸光度值取花粉沉降平衡后的密度梯度離心液，采用分光光度計在290nm波長下，測定待測花粉懸浮層蔗糖溶液的吸光度值，利用標準曲線換算成該層濃度梯度下花粉的濃度值； h :花粉密度計算花粉的密度按照下列公式計算ρ=Σ ITODrrODXPa)其中 P——花粉的密度； ODn——第η層蔗糖梯度溶液中花粉濃度值； OD—所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉濃度值總和； P η—第η梯度蔗糖溶液密度。
3.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟C所述固定方法為利用重金屬絲纏繞在包裹有薄膜的授粉柱頭上，使之能夠沉入到盛有高密度蔗糖溶液的離心管的底部。
4.如權利要求3所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于所述重金屬絲的密度大于離心液的密度，直徑5(Γ200 μ m,纏繞長度l(T50cm。
5.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟B、C所述離心管可根據離心機轉子要求選用1.5mf50ml的離心管。
6.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟D所述的水溶性苯丙胺藍的質量百分比O. O P/Γο. 1%。
7.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟D所述的離心溫度為4°C 30°C。
8.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟D所述的離心時間為5mirT20min。
9.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟D所述的離心機為Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機。
10.如權利要求I所述離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，其特征在于步驟D所述的顯微鏡為Carl Zeiss Axioimager Al紫外突光顯微鏡。
全文摘要
本發明公開了一種離心法測定花粉與柱頭粘附力的方法，包括花粉密度測定、離心液配制、授粉柱頭固定、差速離心洗脫、熒光顯微鏡觀察、粘附力計算等步驟。首先用密度梯度離心法測定花粉密度，其次配置質量百分比為70%的蔗糖溶液作為離心液，然后將待測的授粉柱頭固定在離心管底部，在4~30℃下，將經質量百分比0.01~1%的水溶性苯丙胺藍染色的授粉柱頭，在離心機中洗脫5~20min，顯微鏡下觀察待測授粉柱頭上花粉被洗脫時的離心加速度，根據下列公式計算花粉與柱頭間的粘附力本發明可用于各種花粉與柱頭粘附力的測量，測量精度高，重復性好，簡便易行。
文檔編號G01N19/04GK102879328SQ201210398538
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者姚恒, 馬文廣, 鄭昀曄, 牛永志, 索文龍, 宋碧清, 李元君 申請人:云南省煙草農業科學研究院, 玉溪中煙種子有限責任公司