納米金靶向標記抗體的造影劑及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種納米金靶向標記抗體造影劑，以及其制備方法。本發明采用特定的連接子間接媒介，將熒光標記的抗體定向共價連接到納米金粒子核上，從而提高了抗體的利用率，提高了造影劑的特異性和穩定性。
【專利說明】納米金靶向標記抗體的造影劑及其制備方法
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及生物免疫【技術領域】，具體涉及一種靶向標記抗體的納米金造影劑及其制備方法。
【【背景技術】】
[0002]分子光學造影技術在圖像化分子生物標記方面表現出了光明的前景。分子光學造影技術能夠達到亞細胞的分辨率并且具有實時性和對細胞無侵害性的優點。在分子光學造影技術的領域中以納米為基礎的造影劑在生物學和藥學方面的應用越來越廣泛。而以納米金為載體的成像技術尤其適用于生物學領域。
[0003]由于納米金粒子具有光學穩定性、水溶性以及無毒性，故以納米金為載體的技術可被用于多種成像、傳感及應用治療中。現階段，分子成像用球形的納米金已被用于標記上皮細胞表面癌受體、還有對細胞內肌動蛋白的動力學成像。
[0004]納米金是指金的微小顆粒，通常在水溶液中以膠體的形態存在。目前最經典的制備膠體金的方法是檸檬酸鈉還原法。根據還原劑的種類和濃度的不同，可以在實驗室條件下制備出不同粒徑的膠體金，而且方法簡單、原料價廉。膠體金在其粒徑為51(T550nm的可見光譜范圍內有一吸收峰，吸收波長隨著金顆粒的直徑增大而增加。當粒徑從小到大時，表觀顏色依次呈現出淡橙黃色(< 5nm)、葡萄酒紅色、深紅色和藍紫色(通常為金顆粒的聚集體)的變化。
[0005]膠體金的性質主要取決于金顆粒的直徑及其表面特性。由于其直徑在f IOOnm之間，而大多數的生物分子(如蛋白質、核酸等)的尺寸都在這一尺度內，因此可以利用納米金作為探針進入生物組織內部探測生物分子的生理功能，進而在分子水平上揭示生命過程，或對特異性的靶標進行檢測，或利用其作靶向藥物的載體等。而它獨特的顏色變化也是其應用于生物化學的重要基礎。
[0006]目前，許多科研單位和公司都致力于發展更精確，更靈敏，更高效，更價廉的納米金定量或半定量的快速免疫層析技術。其原理是:利用金納米粒子作為探針，通過抗原抗體反應，使檢測信號得到放大，從而實現對抗原快速靈敏檢測。
[0007]在對單細胞的研究中，盡管熒光和比色原位雜交測試已經被廣泛使用，但相比于其它細胞著色方法，納米金檢測為光鏡觀察提供了一種優良的黑色著色方法。與熒光法相t匕，它不需要昂貴的熒光儀器，也不會隨著觀察時間的延長而漂白或退色。
[0008]而將納米顆粒作為藥物的攜帶載體是納米金顆粒的另一項優勢:將藥物分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面。若同時結合靶向藥物技術即在顆粒表面偶聯特異性的靶向分子(如特異性配體和單克隆抗體等)，通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，并在細胞攝粒作用下將藥物分子引入到細胞內，就可以實現安全有效的靶向給藥。
[0009]此外，隨著載藥納米微粒定位問題的解決，不僅可以減少對藥物不良反應，而且還可將一些特殊藥物輸送到機體天然的生物屏障部位，來治療以往只能通過手術治療的疾病。近年來，國內外學者對納米載體在靶向藥物制備中的應用進行了大量的研究。[0010]以納米金為載體的成像技術尤其適用于生物學領域。由于納米金粒子具有光學穩定性、水溶性以及無毒性，故以納米金為載體的技術可被用于多種成像、傳感及應用治療中。現階段，分子成像用球形的納米金已被用于標記上皮細胞表面癌受體，以及對細胞內肌動蛋白的動力學成像。
[0011]在納米金的應用治療方面，有報到顯示可使用納米殼、納米棒和球型納米對癌細胞進行選擇性的光熱療法。在研究一些特定分子時，可用探針分子靶向標定一些生物標記，并利用有生物標記的探針來研究這些特定分子。這些生物標記主要包括:小肽、寡核苷酸適配子、抗體或抗體片段。
[0012]其中，抗體被廣泛的應用于這些識別部分，主要由于在大量已建立的生物標記中抗體具有高度的親和性和穩定性。這其中關鍵的步驟即是合成分子特異性的納米顆粒，即將探針分子與納米顆粒結合。
[0013]納米金抗體復合物基本上是利用抗體在其等電點處，在靜電作用力下能夠輕易的吸附于納米顆粒表面，而使用高濃度的抗體與納米金顆粒溶液共孵育來制備。然而這種方式有很多的缺陷。主要包括:在納米金抗體復合物的制備中，抗體的濃度要求高dOug/ml)用量大，成本高；由于是利用金顆粒表面的靜電作用力，故抗體在金表面的取向隨機，不能保證是抗體的Fe端與納米金粒子結合，暴露Fab端；由于抗體是以非共價鍵的方式吸附于納米顆粒的表面，所以它們很容易被生物樣品中其他的分子所代替。
[0014]也有利用共價策略將媒介連接子(linker)或通過抗生物素蛋白系統直接將抗體連接于納米金顆粒表面。然而，這些技術都沒有提供能夠使IgG分子定向連接于納米顆粒表面。但是，定向連接卻是抗體至靶目標使其可用的功能最大化的關鍵。
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【發明內容】
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[0015]本發明的目的在于提供一種納米金粒子靶向標記抗體的造影劑，能夠以共價方式，將抗體定向連接到納米金粒子表面。
[0016]本發明提供一種納米金祀向標記抗體的造影劑,包括:納米金粒子核；包覆納米金粒子核并且Fab端暴露的一種或多種抗體，其中的一種抗體靶向于所要成像的分子并連接有熒光基團；通過金硫醇鍵連接到納米金粒子核表面的巰基聚乙二醇化合物；以及具有下式I結構的連接子，其中，所述連接子的巰基端通過金硫醇鍵吸附到納米金粒子核表面，并且所述連接子的酰肼端與抗體的Fe端或非靶位點共價連接。
[0017]
【權利要求】
1.一種納米金祀向標記抗體的造影劑，包括: 納米金粒子核； 包覆納米金粒子核并且Fab端暴露的一種或多種抗體，其中的一種抗體靶向于所要成像的分子并連接有熒光基團； 通過金硫醇鍵連接到納米金粒子核表面的巰基聚乙二醇化合物；以及 具有下式I結構的連接子，
2.根據權利要求1所述的納米金靶向標記抗體造影劑，其特征在于，所述納米金粒子的粒徑為10-25nm。
3.根據權利要求1所述的納米金靶向標記抗體造影劑，其特征在于，所要成像分子為細胞表面分子，并且所述抗體為一種。
4.根據權利要求1所述的納米金靶向標記抗體造影劑，其特征在于，所要成像的分子為活細胞內分子，并且所述抗體有兩種以上，其中的另一種抗體為抗生物素抗體，所述抗生物素抗體上還連接有抗原穿膜肽。
5.根據權利要求1所述的納米金靶向標記抗體造影劑，其特征在于，所述巰基聚乙二醇化合物是分子量為5k Da的甲氧基-聚乙二醇-巰基。
6.一種制備權利要求1-5中任一項所述的納米金靶向標記抗體的造影劑的方法，包括以下步驟: SI氧化抗體:在抗體溶液中添加NaIO4，室溫避光孵育，之后加入磷酸鹽緩沖液停止反應，得到氧化抗體溶液，其中每10-15mg抗體添加0.1mmol的NaIO4 ； S2使抗體與連接子相連:在氧化抗體溶液中添加與抗體等摩爾量的式I的連接子，室溫孵育，之后加入HEPES溶液停止反應，得到抗體-連接子溶液； S3連接納米金粒子:將抗體-連接子溶液加入納米金粒子溶液，室溫震蕩孵育，添加巰基聚乙二醇化合物溶液，室溫震蕩孵育，得到納米金靶向標記抗體造影劑的溶液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟SI中，抗體溶液的pH為7-8。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟S2還包括用10MWC02000g4°C過濾離心，并以HEPES溶液重懸余下溶液，以保證抗體-連接子溶液中抗體的濃度為100ug/ml。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，當所要成像的分子為細胞內分子時，步驟S3還包括:在添加巰基聚乙二醇化合物溶液并在室溫震蕩孵育之后，添加抗原穿膜肽-聚乙二醇混合溶液，室溫震蕩孵育。
10.根據權利要 求6所述的方法，其特征在于，步驟S3還包括用10MWC02000g-2500g4°C過濾離心，并以HEPES溶液重懸沉淀。
【文檔編號】G01N33/533GK103901191SQ201210572229
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】萬曉春, 胡玉婷, 馬遠方, 金言 申請人:深圳先進技術研究院