本發明涉及醫學及生物化學
技術領域：
，具體來說是一種測定糖化血紅蛋白的試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：糖化血紅蛋白是人體血液中紅細胞內的血紅蛋白與血糖結合的產物，血糖和血紅蛋白的結合生成糖化血紅蛋白是不可逆反應，并與血糖濃度成正比，且保持120天左右，所以可以觀測到120天之前的血糖濃度，糖化血紅蛋白的英文代號為HbA1c，糖化血紅蛋白測試通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情況。天然（非糖化）血紅蛋白是A0（2α、2β鏈)，亞組分（HbA1a1,HbA1a2,HbA1b和HbA1c）因血紅蛋白β鏈-N末端纈氨酸的游離氨基與不同碳水化合物糖基化而形成，這些亞組分總稱為HbA1，除了血紅蛋白β鏈的N末端纈氨酸外，血紅蛋白分子內其他游離氨基也參與糖基化（α鏈N末端纈氨酸、賴氨酸ε-氨基）。目前臨床上使用較為廣泛的糖化血紅蛋白的檢測方法主要為高效液相色譜法、親和層析法、電泳法等，這些檢測方法操作復雜、耗時，且需要特殊的儀器，成本較高，市場上也存在其它檢測方法，但是普遍存在測定準確度低的缺陷。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術操作復雜、測定準確度低的缺陷，而提供一種測定糖化血紅蛋白的試劑盒及其制備方法。本發明解決上述技術問題提供的技術方案是：本發明公開了一種測定糖化血紅蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1、試劑R2和試劑R3三液體組分，包括的成分及相應含量為：試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液15~185mmol/L聚乙二醇-20005~25g/L吐溫-801.0~5.0ml/L甘油10~30mmol/L牛血清白蛋白20~60g/L疊氮鈉0.3~0.9g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液50~150mmol/L抗IgG抗體5~16g/L抗HbA1c抗體8~15g/L氯化鈉150~250mmol/L牛血清白蛋白10~35g/L疊氮鈉0.2~0.9g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液45~55mmol/L其溶劑為純化水。作為優選，本發明公開了一種測定糖化血紅蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1、試劑R2和試劑R3三液體組分，包括的成分及相應含量為：試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液100mmol/L聚乙二醇-200015g/L吐溫-803.0ml/L甘油20mmol/L牛血清白蛋白40g/L疊氮鈉0.6g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液100mmol/L抗IgG抗體10g/L抗HbA1c抗體10g/L氯化鈉200mmol/L牛血清白蛋白20g/L疊氮鈉0.5g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液50mmol/L其溶劑為純化水。作為優選，所述的膠乳甘氨酸緩沖液的配制方法為：（1）稱取甘氨酸溶于純化水中，攪拌均勻，配制成100mmol/L甘氨酸緩沖液備用；（2）選擇粒徑為40-500nm的聚苯乙烯微球，用步驟（1）所制得的甘氨酸緩沖液分散聚苯乙烯微球，制備得到所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為1%-5%的溶液；（3）向上述步驟（2）中制得的溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，其中每毫升溶液中加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20℃-37℃的條件下反應2小時，使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀溶于100mmol/L甘氨酸緩沖液中，使得所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為1%-5%，超聲分散，然后再使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀溶于100mmol/L甘氨酸緩沖液中，使得所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為1%-5%，超聲分散，再使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，最后去上清，分離得到沉淀物；（4）用步驟（1）制得的甘氨酸緩沖液稀釋血紅蛋白吸附劑，制備得到所含的血紅蛋白吸附劑的質量濃度為1%-5%的溶液；（5）最后將步驟（3）分離出的沉淀物溶于步驟（4）所制得的含有血紅蛋白吸附劑的溶液中即可，使得聚苯乙烯微球的質量濃度為1%-5%為止，在20℃-37℃的條件下封閉24小時即可制備得到膠乳甘氨酸緩沖液。作為優選，本發明還公開了上述測定糖化血紅蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，包括以下步驟：（a）按照下列組分含量配制好試劑：試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液15~185mmol/L聚乙二醇-20005~25g/L吐溫-801.0~5.0ml/L甘油10~30mmol/L牛血清白蛋白20~60g/L疊氮鈉0.3~0.9g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液50~150mmol/L抗IgG抗體5~16g/L抗HbA1c抗體8~15g/L氯化鈉150~250mmol/L牛血清白蛋白10~35g/L疊氮鈉0.2~0.9g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液45~55mmol/L其溶劑為純化水；（b）將待測樣本和試劑R3混合在一起，使用溶血素稀釋液對待測樣本進行處理；（c）將處理后的待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；（d）用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；（e）根據吸光度變化值計算出樣本中的糖化血紅蛋白的濃度。作為優選，步驟（b）中，所述的待測樣本和試劑R3的體積比為1：50。作為優選，步驟（c）中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。作為優選，步驟（c）中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1：150之間。與現有技術相比，本發明具有以下有益優點：樣品中的血紅蛋白（Hb）和糖化血紅蛋白（HbAlc）與聚苯乙烯微球發生非特異性吸附而固相化，當加入HbAlc特異性抗體后形成膠乳-HbAlc-抗人HbAlc抗體的復合物，此復合物與抗IgG抗體發生凝集反應產生一定濁度，其濁度高低與膠乳表面固相化的HbAlc量成正相關，通過測定濁度并與HbAlc校準曲線進行換算，求出樣品中HbAlc占總Hb的百分含量。樣本中糖化血紅蛋白的活性（%）=CS×（%）式中：ΔAT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值ΔAS以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值CS校準液中HbA1c的濃度。本發明具有以下有益優點：試劑R1中添加了甘油作為助懸劑，可充分懸浮聚苯乙烯微球，避免非特異性的凝集，可與血紅蛋白和糖化血紅蛋白迅速結合，避免因聚苯乙烯微球的凝集導致待測物質與試劑結合不充分，提高了反應的靈敏度。具體實施方式以下結合具體實施例進一步說明，但本發明并不僅限于這些實施例。實施例1本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1、試劑R2和試劑R3三液體組分，其中試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液100mmol/L聚乙二醇-200015g/L吐溫-803.0ml/L甘油20mmol/L牛血清白蛋白40g/L疊氮鈉0.6g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液100mmol/L抗IgG抗體10g/L抗HbA1c抗體10g/L氯化鈉200mmol/L牛血清白蛋白20g/L疊氮鈉0.5g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液50mmol/L其溶劑為純化水。實施例2本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液15mmol/L聚乙二醇-200025g/L吐溫-801.0ml/L甘油30mmol/L牛血清白蛋白20g/L疊氮鈉0.9g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液50mmol/L抗IgG抗體16g/L抗HbA1c抗體8g/L氯化鈉250mmol/L牛血清白蛋白10g/L疊氮鈉0.9g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液55mmol/L其溶劑為純化水。實施例3試劑盒的制備和使用方法1、制備膠乳甘氨酸緩沖液：（1）稱取甘氨酸溶于純化水中，攪拌均勻，配制成100mmol/L甘氨酸緩沖液備用；（2）選擇粒徑為450nm的聚苯乙烯微球，用步驟（1）所制得的甘氨酸緩沖液分散聚苯乙烯微球，制備得到所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為3%的溶液；（3）向上述步驟（2）中制得的溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，其中每毫升溶液中加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25℃的條件下反應2小時，使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀溶于100mmol/L甘氨酸緩沖液中，使得所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為3%，超聲分散，然后再使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀溶于100mmol/L甘氨酸緩沖液中，使得所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為3%，超聲分散，再使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，最后去上清，分離得到沉淀物；（4）用步驟（1）制得的甘氨酸緩沖液稀釋血紅蛋白吸附劑，制備得到所含的血紅蛋白吸附劑的質量濃度為3%的溶液；（5）最后將步驟（3）分離出的沉淀物溶于步驟（4）所制得的含有血紅蛋白吸附劑的溶液中即可，使得聚苯乙烯微球的質量濃度為3%為止，在25℃的條件下封閉24小時即可制備得到膠乳甘氨酸緩沖液；2、按照下列組分含量配制好試劑：試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液100mmol/L聚乙二醇-200015g/L吐溫-803.0ml/L甘油20mmol/L牛血清白蛋白40g/L疊氮鈉0.6g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液100mmol/L抗IgG抗體10g/L抗HbA1c抗體10g/L氯化鈉200mmol/L牛血清白蛋白20g/L疊氮鈉0.5g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液50mmol/L其溶劑為純化水；3、全自動生化分析儀參數設置（a）檢測溫度：37℃；（b）檢測波長：主波長660nm；（c）反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度A1，5min后讀取吸光度A2，計算吸光度變化ΔA＝A2-A1；(d)反應方向：正反應；4、檢測步驟（a）將5.5μl待測樣本和275μl試劑R3混合在一起，使用溶血素稀釋液對待測樣本進行處理；（b）向步驟（a）制得的的溶液中添加210μl試劑R1，混合均勻；（c）將混勻后的溶液在37℃的條件下孵育5min；（d）加入70μl試劑R2，立即測定讀取吸光度A1，5min后讀取吸光度A2，計算吸光度變化ΔA＝A2-A1；(e)根據樣本中糖化血紅蛋白的活性（%）=CS×（%）計算出樣本中的糖化血紅蛋白的濃度。實施例4試劑盒的制備和使用方法1、制備膠乳甘氨酸緩沖液：（1）稱取甘氨酸溶于純化水中，攪拌均勻，配制成100mmol/L甘氨酸緩沖液備用；（2）選擇粒徑為450nm的聚苯乙烯微球，用步驟（1）所制得的甘氨酸緩沖液分散聚苯乙烯微球，制備得到所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為3%的溶液；（3）向上述步驟（2）中制得的溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，其中每毫升溶液中加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25℃的條件下反應2小時，使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀溶于100mmol/L甘氨酸緩沖液中，使得所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為3%，超聲分散，然后再使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀溶于100mmol/L甘氨酸緩沖液中，使得所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為3%，超聲分散，再使用離心機，在15000rmp/min的轉速下離心30分鐘，最后去上清，分離得到沉淀物；（4）用步驟（1）制得的甘氨酸緩沖液稀釋血紅蛋白吸附劑，制備得到所含的血紅蛋白吸附劑的質量濃度為3%的溶液；（5）最后將步驟（3）分離出的沉淀物溶于步驟（4）所制得的含有血紅蛋白吸附劑的溶液中即可，使得聚苯乙烯微球的質量濃度為3%為止，在25℃的條件下封閉24小時即可制備得到膠乳甘氨酸緩沖液；2、按照下列組分含量配制好試劑：試劑R1：膠乳甘氨酸緩沖液15mmol/L聚乙二醇-200025g/L吐溫-801.0ml/L甘油30mmol/L牛血清白蛋白20g/L疊氮鈉0.9g/L其溶劑為純化水試劑R2：甘氨酸緩沖液50mmol/L抗IgG抗體16g/L抗HbA1c抗體8g/L氯化鈉250mmol/L牛血清白蛋白10g/L疊氮鈉0.9g/L其溶劑為純化水試劑R3：溶血素稀釋液55mmol/L其溶劑為純化水；3、全自動生化分析儀參數設置（a）檢測溫度：37℃；（b）檢測波長：主波長660nm；（c）反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度A1，5min后讀取吸光度A2，計算吸光度變化ΔA＝A2-A1；(d)反應方向：正反應；4、檢測步驟（a）將5.5μl待測樣本和275μl試劑R3混合在一起，使用溶血素稀釋液對待測樣本進行處理；（b）向步驟（a）制得的的溶液中添加210μl試劑R1，混合均勻；（c）將混勻后的溶液在37℃的條件下孵育5min；（d）加入70μl試劑R2，立即測定讀取吸光度A1，5min后讀取吸光度A2，計算吸光度變化ΔA＝A2-A1；(e)根據樣本中糖化血紅蛋白的活性（%）=CS×（%）計算出樣本中的糖化血紅蛋白的濃度。表1為實施例1所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的糖化血紅蛋白的濃度為5.50%，測定結果見表1：表1第1次（%）第2次（%）第3次（%）均值（%）偏差（%）實施例15.415.755.545.571.21實施例25.275.795.785.612.06由表1可知，本發明所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒對質控品1的測定結果偏差較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。表2為實施例1所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的糖化血紅蛋白的濃度為14.00%，測定結果見表2：表2第1次（%）第2次（%）第3次（%）均值（%）偏差（%）實施例114.8714.6113.7917.423.02實施例213.1813.1313.4213.245.40由表2可知，本發明所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒對質控品2的測定結果偏差較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。表3為實施例3所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復測定以及實施例4所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復測定，對所得的結果進行SD和CV的計算，結果如下：表3由表3可知本發明所制得的測定糖化血紅蛋白的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可知，實施例3為最優的選擇。上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術領域：
中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。當前第1頁1 2 3