一種促甲狀腺激素受體抗體化學發光免疫測定試劑盒及其制備方法與流程

本發明涉及體外診斷免疫測定領域，具體地，本發明提供了一種化學發光免疫測定促甲狀腺激素受體抗體試劑盒及其制備方法。

背景技術：

自身免疫性甲狀腺病（autoimmune thyroid disease，AITD）是一組發病機制復雜的器官特異性自身免疫疾病，包括Graves 病（Graves’ disease，GD）、橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）等。人促甲狀腺激素受體(hTSHR)是AITD的主要靶抗原, 在AITD的發病中起重要作用。hTSHR是存在人甲狀腺濾泡上皮細胞（TEC）膜上的一種糖蛋白，它與促甲狀腺素（TSH）結合后，調節TEC的生長、分化及其合成和釋放甲狀腺激素的功能。在環境和遺傳因素基礎上，機體免疫功能異常變化導致AITD，hTSHR 是AITD的主要自身抗原之一，刺激機體產生促甲狀腺素受體抗體（TRAb），該自身抗體屬于異質性抗體，包括甲狀腺阻斷性抗體（TSBAb）和甲狀腺刺激性抗體（TSAb），前者與TSHR 特異位點結合而阻止TSH 與TSHR 的結合及其生理作用的發揮，導致甲狀腺萎縮和功能下降，表現為甲狀腺功能減退（甲減），多見于HT的后期；后者模擬TSH功能，長期持續地刺激甲狀腺激素合成釋放而導致GD，表現為甲狀腺功能亢進。

目前臨床測定促甲狀腺激素受體抗體的常見方法有酶聯免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學發光法，但這些方法都存在著一些不足之處。

一、酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（ELISA）被廣泛應用，但該方法也存在著下述的不足之處：

(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進行獨立的、單人份的測定；

(2) 定量測定所用的試劑種類較多，每一種測定試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；

(3) 缺少對測定信息的相應標注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知悉測定試劑的生產批號及有效期信息，而且所知悉的信息在測定過程中不受控，具有很大的隨意性；

(4) 測定試劑在測定過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響測定結果的準確性；

(5) 測定過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復雜，容易發生操作差錯，測定結果的準確度和精密度較差；

(6) 在測定項目成套試劑的數量配置及使用上均為項目數×48/96人份，如果需要測定10個項目，則試劑的配置及使用數須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要測定10個不同的項目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經濟合理的缺點。

二、放射免疫分析法

放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復雜、操作時間長、測定結果不穩定、試劑保存時間短、試劑盒操作自動化程度低、配套儀器價格昂貴等不足之處。

三、化學發光法

化學發光法按發光原理可分為直接化學發光和酶促化學發光。

酶促化學發光主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過氧化物酶主要缺點為：魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會被H₂O₂氧化自身發光，本底相對較高，影響信噪比，反應動力學復雜，影響因素多，結果不夠穩定，要得到靈敏度高且平臺期長的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點為：底物達到平臺期的時間長，底物成本高，導致測定成本高，患者負擔重。

吖啶酯作為標記物的直接化學發光相比酶促化學發光具有明細優勢，主要表現在：反應不需要催化劑，只要堿性環境即可進行，反應迅速，背景發光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩定性好，可以兩點定標，體系簡單，激發液成本低，吖啶酯易與蛋白質聯結，且聯結后光子產率不減少。

技術實現要素：

目前促甲狀腺激素受體抗體測定技術存在以下缺點：測定成本高、測定靈敏度低、測定線性范圍窄、重現性低、不能定量、操作復雜等。

本發明正是為了克服以上所述缺點，公開了一種測定成本低、靈敏度高、重現性高、可以定量、操作簡單的促甲狀腺激素受體抗體試劑盒及其制備方法。本發明首先制備化學發光免疫分析試劑盒，主要包括：促甲狀腺激素受體包被的磁顆粒、促鼠抗人IgG抗體包被的吖啶酯以及促甲狀腺激素受體抗體定標品；然后利用全自動化學發光免疫分析儀對定標品進行測定，繪制標準曲線，內置于電腦軟件，測試實際樣本，根據樣本發光值計算樣本濃度；最后對促甲狀腺激素受體抗體全自動化學發光免疫分析系統進行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價。

本發明與目前技術相比，具有以下優點：

1、本發明選擇吖啶酯作為標記材料，并應用于化學發光免疫分析系統，該發光體系為直接化學發光，與傳統的酶促化學發光相比，該反應不需要酶的參與，更加節約成本；

2、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統測定靈敏度高，能夠達到0.3IU/L，相比其它的促甲狀腺激素受體抗體測定方法靈敏度至少提高了6倍；

3、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統重復性高，批內及批間差均在5%以內，這是其它化學發光免疫分析系統難以達到的；

4、本發明的化學發光免疫分析系統已實現樣本的定量，通過內置標準曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；

5、本發明的化學發光免疫分析系統已實現全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。

附圖說明

圖1為實施例3得到的促甲狀腺激素受體抗體標準曲線圖。

具體實施方式

實施例1：促甲狀腺激素受體抗體化學發光免疫測定試劑盒制備方法

（1）促甲狀腺激素受體包被的納米磁珠制備：

取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1μm）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 促甲狀腺激素受體，室溫下混懸2-10h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到促甲狀腺激素受體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃備用。

（2）鼠抗人IgG抗體標記的吖啶酯的制備：

取50μL 25mg/mL的鼠抗人IgG抗體，加入150μL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2μL 5mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應，1-2h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加入得到的鼠抗人IgG抗體標記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到鼠抗人IgG抗體標記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃備用。

（3）促甲狀腺激素受體抗體定標品的制備：

用標準品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將促甲狀腺激素受體抗體配置成濃度為0.03IU/L、4.1IU/L、10.75IU/L、24.5IU/L、30.55IU/L、38.56IU/L，每瓶0.5mL分裝凍干，4℃保存備用。

（4）化學發光預激發液的配制：

量取1.0升純化水，依次加入80μL質量分數為20%的雙氧水(H₂O₂)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。

(5)化學發光激發液的配制：

量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton X-405，搖勻后避光存放。

實施例2：促甲狀腺激素受體抗體化學發光免疫測定方法：

本發明以全自動化學發光免疫分析儀為測定工具，本發明的方法學模式為間接法，即儀器依次加入預稀釋后40μL的樣品、50μL的促甲狀腺激素受體包被的磁顆粒，反應20min后，進行磁分離，加入50μL的鼠抗人IgG抗體標記的吖啶酯，反應20min，再次清洗，依次加入50μL化學發光預激發液、50μL化學發光激發液進行發光反應，最后記錄發光強度，從標準曲線計算出被測樣品的促甲狀腺激素受體抗體含量。

實施例3：促甲狀腺激素受體抗體化學發光免疫測定試劑盒性能評價

測定曲線見附圖1。

靈敏度的測定：

參照CLSI EP17-A 文件推薦實驗方案，計算促甲狀腺激素受體抗體化學發光免疫分析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.3IU/L。

線性的測定：

對濃度為0.03IU/L、7.72IU/L、15.41IU/L 、23.1IU/L、30.79IU/L、38.48IU/L標準品做線性分析，計算線性相關系數，r=0.9992，另外，該試劑盒對促甲狀腺激素受體抗體樣品測定的線性范圍為0.3IU/L-40IU/L。

精密度測定：

取濃度為5.98IU/L及31.99IU/L兩個促甲狀腺激素受體抗體樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進行測定，計算試劑盒批內及批間差，結果表明該試劑盒批內及批間差均小于5%。

干擾性實驗：

取混合血清分別添加干擾物包括：血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯、RF干擾分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以±10%為可接受范圍。結果表明，干擾性均達到NCCLS有關標準的文件，可用于促甲狀腺激素受體抗體狀況的準確評估。

實施例4：促甲狀腺激素受體抗體化學發光免疫測定試劑盒的靈敏度對比實驗分別用化學發光測定方法和傳統的酶聯免疫吸附法對濃度為0IU/L的校準品或樣本稀釋液進行測定，重復測定20次，得出20次測量結果的RLU值（相對發光值），計算其平均值（M）和標準差（SD），得出M+2SD，將該發光值代入校準曲線計算得到相應的濃度值。采用化學發光測定方法得到的濃度值為0.3IU/L，相對于傳統的酶聯免疫吸附法最低檢測限2 IU/L，提高了約6倍。