一種用于農藥檢測的適配體傳感器的制備方法與流程

本發明涉及一種用于檢測農藥的適配體傳感器的制備方法，屬于農產品安全檢測技術領域。

技術背景

隨著我國人民生活水平不斷提高，農產品的質量安全問題越來越受到關注，尤其果品、蔬菜中農藥殘留問題已經成為公眾關注的焦點，常用農藥如毒死蜱、對硫磷、丙溴磷等具有一定的內吸性，可以通過食物鏈的富集作用轉移至人體，對人體具有潛在致癌作用，因此，農藥一直是環境和食品安全檢測的重要項目，加強對農產品中農藥殘留的檢測對保護生態環境，尤其是保障人類健康有著十分深遠的意義。

常用的農藥殘留快速檢測方法有酶抑制法和免疫傳感器法，可以實現有機磷農藥的現場快速檢測，具有較好的實用價值，然而，酶抑制法存在回收率低、錯檢、漏檢比例較高、重復性差、難以滿足低殘留和定量檢測的要求等缺點，免疫傳感器是基于抗原和抗體特異性結合所引發的免疫反應的原理所研制的傳感器，但是所用生物敏感物質抗體獲取比較昂貴，處理環境比較苛刻，與傳統的免疫分析方法相比，適配體傳感器具有特異性強、分析速度快、結構簡單、成本低廉等優點，適配體傳感器的敏感界面是固定適配體到電極的表面，其直接影響適配體傳感器的穩定性、靈敏度和選擇性等主要性能。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、靈敏度高、選擇性好的檢測農藥殘留的適配體傳感器制備方法，采取的技術方案為：

所述一種檢測農藥的適配體傳感器的制備，其特征在于，適配體傳感器的傳感界面組成包括導電炭黑-殼聚糖、氧化石墨烯復合四氧化三鐵納米復合物，進而固定農藥的核酸適配體，最后用牛血清蛋白即BSA封閉，得到檢測農藥的適配體傳感器。

所述方法的步驟如下：

1) 清洗、活化并測試裸玻碳電極，獲得預處理玻碳電極；

2) 制備炭黑-殼聚糖復合液，滴涂到步驟1)的預處理玻碳電極上；

3) 制備氧化石墨烯-四氧化三鐵復合納米材料，并用殼聚糖溶液進行分散，將此分散液滴涂到在步驟2)所得的修飾電極上；

4) 在步驟3)所得的修飾電極上固定農藥適配體；

5) 用牛血清蛋白封閉步驟4)所得的電極，得到適配體生物傳感器。

根據步驟1)所述清洗、活化并測試裸玻碳電極是利用熱 piranha 溶液浸泡裸玻碳電極后，用Al₂O₃漿拋光，再依次用去離子水、HNO₃、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環伏安法活化，并通過檢測裸電極循環伏安曲線峰電位差測試電極。

根據步驟2)所述在預處理電極表面分層滴涂導電炭黑-殼聚糖溶液，是先將0.25 g 殼聚糖溶解于50 mL 乙酸溶液中持續攪拌至完全分散得到殼聚糖溶液，再將1.0 mg 導電炭黑加入到1.0 mL 上述殼聚糖溶液中超聲分離50 min得到導電炭黑-殼聚糖溶液，取7 μL的炭黑-殼聚糖溶液滴涂在預處理玻碳電極上，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的液體沖洗掉，得到炭黑-殼聚糖修飾的玻碳電極。

根據步驟3)所述在電極表面滴涂氧化石墨烯-四氧化三鐵復合納米材料，是先采用 Hummers 方法制備氧化石墨烯，再利用熱溶劑法制備氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物，將7 μL的氧化石墨烯-四氧化三鐵復合納米材料滴涂在電極上，在空氣中干燥，得到氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物修飾的電極。

根據步驟4)所述在工作電極上滴涂農藥適配體，是將步驟3)所得電極浸入20 μL的2.5 μM適配體溶液中，并在4 ℃下靜置12 h，之后用pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗去除未吸附上的適配體，得到適配體修飾的電極。

根據步驟5)所述用牛血清蛋白封閉固定電極，是指將固定電極浸入0.5%的BSA溶液中26 ℃下靜置2 h。

所述方法的具體步驟如下：

1)利用熱Piranha溶液浸泡裸玻碳電極后，用Al₂O₃漿拋光，再依次用去離子水、HNO₃、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環伏安法活化，并通過檢測裸電極循環伏安曲線峰電位差測試電極，得到預處理電極；

2)在50 mL 1.0% 乙酸溶液中加入0.25 g殼聚糖，配制成0.5% 殼聚糖溶液，將1.0 mg導電炭黑加入到1.0 mL新配制的0.5% 殼聚糖溶液中，通過超聲處理直到均勻分散，將制備好的炭黑-殼聚糖復合物在4 ℃下存儲；

3)采用Hummers方法制備氧化石墨烯，再利用熱溶劑法制備氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物，將40 mg氧化石墨烯加入到30 mL 乙二醇中，再分別加入3 g 氯化鐵，9 g 醋酸鈉和30 mL 乙二胺(EDA)，超聲分散得到均勻溶液，然后回流加熱8 h，經過離心分離后水洗數次，真空干燥得到氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物；

4)將7 μL的步驟2)制備的導電炭黑-殼聚糖復合物滴涂在步驟1)所得的預處理玻碳電極上，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的復合物沖洗掉，得到導電炭黑-殼聚糖修飾的電極；

5)滴涂7 μL的步驟3)制得的氧化石墨烯-四氧化三鐵復合納米材料滴涂到步驟4)所得修飾電極的表面上，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的復合物沖洗掉，得到氧化石墨烯-四氧化三鐵復合修飾的電極；

6)將步驟5)得到的電極浸入20 μL的2.5 μM農藥適配體溶液中并在4 ℃下靜置12 h，之后用pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗去除未吸附上的適配體，得到適配體修飾的電極；

7)將步驟6)所得固定電極浸入0.5%的BSA溶液中26 ℃下靜置2 h。

所述一種檢農藥的適配體傳感器的制備，其特征在于：適配體傳感器的敏感界面組成包括導電炭黑-殼聚糖復合膜和氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物，然后固定適配體。

所述一種檢測農藥的適配體傳感器的制備，其特征在于：玻碳電極(d=3 mm)的清洗，傳感器傳感界面的構建及過程表征(制備炭黑-殼聚糖、氧化石墨烯復合四氧化三鐵納米復合材料并以殼聚糖作為分散劑進行分散，利用納米材料的協同作用共同修飾電極)，適配體傳感器工作曲線的建立，適配體傳感器性能的檢測，適配體傳感器對實際樣品的檢測。

所述一種檢測農藥的適配體傳感器的制備，其特征在于：實驗條件的優化，主要包括測試底液pH和孵育時間；所制備的適配體傳感器的工作曲線為：ΔI=14.82×logC+13.26 (ng/mL) (R²=0.993，0.1-10⁵ ng/mL)；適配體傳感器性能檢測包括特異性、重現性、穩定性、再生性以及適配體傳感器對蔬菜樣品回收率的測定。

其制備原理為：適配體傳感器以適配體作為識別元件，通過固定化技術將適配體結合到感受器表面，發生特異性識別反應后，生成的復合物與產生的物理或化學信號相關聯，由換能器將其轉化為與待測物質濃度(或活度)有關的可定量或者可處理的物理化學信號，再經過二次儀表放大并且輸出信號，從而實現對待測物質的檢測，本發明采用以殼聚糖作為分散劑制備的導電炭黑和氧化石墨烯復合四氧化三鐵納米復合物對玻碳電極進行修飾，氧化石墨烯復合四氧化三鐵納米材料，通過傳統的溶劑熱方法在通過加熱、回流、提純、清洗、干燥等步驟制備。導電炭黑是一種典型的特種炭黑，因其良好的導電性能和較高的性價比，廣泛應用于導電和防靜電制品中，氧化石墨稀(graphene oxide, GO)作為石墨稀的衍生物，為氧化石墨的剝落物，可用強質子酸處理原始石墨，再進行氧化生成氧化石墨，氧化石墨稀價格便宜，容易制得，同時它具有較好的親水性和較低的生物毒性，因此在生物醫學、生物分析、以及生物傳感等領域具有潛在的應用價值，殼聚糖(CS)屬于多糖類，它具有優異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜后具有很好的吸附性、穩定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結構使它被廣泛用于生物分子的固定和修飾電極的制備，殼聚糖的良好的生物相容性，可作為適配體的固定載體，為適配體在電極表面的固定提供了一個良好的生物界面，保持了適配體的生物活性以用來和農藥進行有效的特異性結合，采用本發明制成的適配體傳感器可以在蔬果采收、上市前進行農藥殘留的快速測定，直接對農藥殘留量是否超標進行檢測，避免因食用含有殘留農藥的蔬果而引起中毒，為農產品安全生產與消費提供殘留檢測的技術支撐。

為達到以上目的，采取以下技術方案實現：一種檢測農藥的適配體傳感器的制備，其特征在于：(1) 適配體傳感器制備前裸玻碳電極的清洗、活化和性能測試，如果測試循環伏安曲線中的峰電位差在100 mV以下，氧化峰和還原峰對稱，則所述玻碳電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求；(2) 清洗好的裸玻碳電極表面滴涂分散均勻的炭黑-殼聚糖復合液，繼而修飾氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物，然后固定適配體，最后用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結合位點，適配體傳感器制備結束后，放入冰箱里4 ℃保存備用。

為達到以上目的，采取以下技術方案實現：一種檢測農藥的適配體傳感器的制備，其特征在于：(1) 將上述制備好的適配體傳感器在工作底液中以不同的掃速做循環伏安方法掃描，可以得到峰值和掃速的關系，得到是受擴散控制的；(2) 配置一系列的農藥標準液，進行循環伏安掃描，得到抑制率，進一步得出上述制備的適配體傳感器的工作曲線、檢測范圍和檢測限；(3) 配置一系列經常混合使用的農藥溶液，以檢測所制備的適配體傳感器的特異性；(4)通過循環伏安掃描多段并且于冰箱中放置一段時間再次測量驗證上述適配體傳感器的穩定性，通過解離和再次免疫檢測其再生性能；(5) 對實際果蔬樣品進行分析得出該適配體傳感器的回收率。

本發明使用的氧化石墨烯是用強質子酸處理原始石墨，再進行氧化生成氧化石墨，然后采用傳統的溶劑熱方法經過加熱、回流、提純、清洗、干燥等步驟制備制備氧化石墨烯-四氧化三鐵納米復合材料，再以具有良好生物相容性和成膜性的殼聚糖作為分散劑進行分散，得到的納米復合物膜能夠促進電化學反應中電子的傳遞，提高電極上的響應電流，用以制備響應信號強和靈敏度高的適配體傳感器。

所述適配體傳感器的制備工藝如下：(1) 取7 μL分散均勻的導電炭黑-殼聚糖納米復合膜滴涂在預處理好的玻碳電極表面，常溫下靜置3 h，用pH7.5的PBS沖洗電極表面；(2) 電極表面晾干后，取7 μL氧化石墨烯-四氧化三鐵納米復合材料的殼聚糖分散液滴涂在電極表面，常溫下靜置2 h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮氣吹干；(3) 將上述經納米材料修飾好的電極浸入在農藥適配體溶液中，4 ℃條件下浸泡12 h，取出后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面；(4) 最后將上述制備好的電極浸于0.5%的BSA溶液中，室溫下靜置2h，進而封閉非特異性結合位點，適配體傳感器制作完成，保存在4 ℃條件下備用。

本發明的有益效果：

首先，本發明引入了一種超級電容器電極材料：導電炭黑-殼聚糖復合物，利用導電炭黑優良的導電性能及殼聚糖優異的生物相容性、成膜性，有效地提高了導電性及電容，利用氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物的殼聚糖混合溶液提高電極的比表面積，協同炭黑修飾電極，顯著地增強了信號響應；

其次，本發明制備的適配體傳感器檢測范圍較寬，線性范圍為0.1-10⁵ ng/mL，檢測限較低，達到0.033 ng/mL，對制備好的適配體傳感器保存三周后檢測，其電流響應仍可保持在初始電流的80%以上，穩定性良好，且該適配體傳感器可有效地復活5次，再生性較好；

第三，本發明所制備的適配體傳感器的檢測結果與氣相色譜法的檢測結果一致，可作為蔬菜上市前農藥殘留快速檢測的輔助手段。

附圖說明

圖1導電炭黑透射電鏡圖；(A，低倍下導電炭黑透射電鏡圖；B，高倍下導電炭黑透射電鏡圖)；

圖2 氧化石墨烯、氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物掃描電鏡圖；(A，低倍下氧化石墨烯掃描電鏡圖；B，高倍下氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物掃描電鏡圖)；

圖3 電極組裝過程阻抗圖譜；(a，裸玻碳電極；b，導電炭黑-殼聚糖復合物修飾后的電極；c，氧化石墨烯-四氧化三鐵修飾后的電極；d，固定適配體后的電極；e，牛血清白蛋白封閉后的電極)；

圖4 適配體傳感器工作條件優化：pH值和孵育時間的優化；

圖5 適配體傳感器的工作曲線；(A，從a到h農藥標準溶液的濃度分別為10⁵, 10⁴, 1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/mL；B，適配體傳感器的工作標準曲線)。

具體實施方式

實施例1導電炭黑-殼聚糖納米復合液的制備

將殼聚糖(CS)溶于1.0%的乙酸溶液中，配制0.5% CS溶液，室溫下磁力攪拌至殼聚糖完全溶解，將1.0 mg導電炭黑粉末溶解于1.0 mL 上述CS溶液中，超聲分散直至得到溶解均勻的復合溶液，圖1為導電炭黑-殼聚糖復合物的透射電鏡圖，A圖為低倍下掃描圖，B圖為高倍鏡投射圖；

實施例2 氧化石墨烯-四氧化三鐵復合物的制備

氧化石墨烯是通過改進的Hummers方法制得，具體制備步驟如下：將石墨粉末加入H₂SO₄ (12mL）、K₂S₂O₈ (2.5 g)、P₂O₅ (2.5 g) 的混合液中，80℃反應 4.5 h，然后加入 0.5 L水稀釋，并過濾洗滌以除去多余的酸，所得的預產物在室溫下過夜干燥，然后將預氧化的石墨加入H₂SO₄ (120 mL)中，在冰水浴保護下逐步加入KMnO₄ (15 g)，此混合物在 35℃下攪拌反應 30 min、90℃下反應 90 min后，加入250 mL水稀釋，使其沸騰反應 25 min，再攪拌 2 小時后，加入 0.7 L水和 20 mL 30%H₂O₂溶液終止反應，混合物過濾后用 1:10 的稀鹽酸沖洗數次后，再用水沖洗至中性，然后將所得產物進一步透析純化除去剩余的金屬離子，透析一星期后，將得到的氧化石墨在室溫條件下超聲剝離 30 min，最終GO儲備液的濃度大約為 0.5 mg·mL^-1，圖2A即為氧化石墨烯的低倍掃描電鏡圖，從圖中可以看到氧化石墨烯非常薄的片層結構，氧化石墨烯復合四氧化三鐵是通過溶劑熱法制得：40 mg氧化石墨烯混合3.0 g FeCl₃·6H₂O，9.0 g CH₃COONa 和30 mL 乙二胺 (EDA)超聲得到均相溶液，將此混合溶液加熱回流8 h，將混合物進行離心分離，然后分別用水和酒精清洗數次，60 ℃真空干燥即得到氧化石墨烯復合四氧化三鐵，圖2B即為氧化石墨烯復合四氧化三鐵的掃描電鏡圖，球形的四氧化三鐵離子負載到片層氧化石墨烯上；

實施例3 玻碳電極的清洗、活化和測試

玻碳電極修飾前，首先浸入熱的“piranha”溶液 (H₂SO₄: H₂O₂ = 3:1)中浸泡15 min，用水清洗干凈，接下來用0.3 μm、30 nm的Al₂O₃漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用去離子水清洗去除表面污物，然后依次用6 mol/L的HNO₃、無水乙醇和去離子水各自超聲清洗5 min，氮氣環境下干燥。

玻碳電極的活化：徹底清洗后，電極在0.5 mol/L H₂SO₄溶液中用循環伏安法活化，掃描范圍1.0 V~-1.0 V，反復掃描直至達到穩定的循環伏安圖為止。

預處理好的玻碳電極的測試：在含有1×10^-3 mol/L K₃Fe(CN)₆的0.20 mol/L KNO₃溶液中跑循環伏安曲線，掃描速度50 mV/s，掃描范圍為-0.1 V~0.6 V，以測試玻碳電極的性能；當循環伏安曲線中的峰電位差在100 mV以下，所述玻碳電極可使用，否則要重新進行清洗，處理所述玻碳電極，直到符合要求，圖3為玻碳電極修飾過程的阻抗圖，在玻碳電極表面分別修飾炭黑-殼聚糖復合物及氧化石墨烯-四氧化三鐵納米復合物之后，阻抗值依次減小，由于二者均具有良好的導電性，固定適配體、封閉牛血清白蛋白之后，阻抗分別增大，是由于其均為蛋白分子，修飾在電極表面會形成絕緣層從而阻礙電子的傳遞。

實施例4 適配體傳感器的制備

取7 μL分散均勻的炭黑-殼聚糖復合液滴涂在電極表面，常溫下靜置使其干燥，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮氣吹干，再取7 μL制備好的氧化石墨烯-四氧化三鐵納米復合物溶液滴涂在電極上，常溫下干燥，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮氣吹干，再將上述經納米材料修飾的電極浸在20 μL 2.5 μM的農藥適配體溶液中，4 ℃條件下浸泡12 h，取出后用PBS緩沖液沖表面，晾干待用，最后將上述電極浸入0.5%的BSA溶液中室溫下靜置2 h，以封閉電極上非特異性結合位點，適配體傳感器制作完成，保存在4 ℃條件下備用。

實施例5 適配體傳感器使用條件的優化及測定

從測試底液pH和孵育時間對所制備的適配體傳感器的實驗條件進行優化，測試底液 pH的范圍為6.0~8.5，孵育時間的范圍為10~60 min，經過試驗分析如圖4所示，測試底液的最佳pH值為7.5，最佳孵育時間為40 min。

分別配置濃度為10⁵, 10⁴, 1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/mL的農藥標準溶液，將上述制備好的適配體傳感器分別浸入不同濃度的農藥標準溶液，在常溫下孵育40 min，檢測反應前后電流變化得到其工作曲線（圖5）。

選5根于相同條件下制備好的適配體傳感器檢測其重現性；連續15天依次檢測相同濃度的農藥溶液以檢測其穩定性；將反應后的傳感器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.8)解離農藥5 min后再次檢測其再生能力，結果表明該傳感器具有良好的重現性、穩定性以及再生性。

把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3次，噴灑上一定濃度的農藥，放置5 h后，用10 mL丙酮/0.1 M pH7.5磷酸鹽緩沖溶液(1/9, v/v)做溶劑超聲處理20 min，然后再離心10 min (10000 rpm)，得到的上清液用來檢測實際樣品的回收率，其回收率可以達到96.0%~106.0%，加標回收率檢測的相對標準偏差為1.21%~3.70%，且傳感器的重現性良好。

此適配體傳感器檢測農藥農藥殘留的檢測方法操作工藝簡單，檢測時間較短，檢測農藥濃度范圍廣，靈敏度高，再生能力高以及對實際樣品分析有較好的回收率和重現性，符合我國農藥殘留快速檢測技術發展和國際化要求，雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。