本發明涉及了一種貞芪扶正制劑中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素四種有效成分的含量測定方法，屬于中藥質量檢測
技術領域：
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背景技術：
：貞芪扶正制劑處方有女貞子、黃芪兩味中藥材組成，具有扶正固本、補氣養陰的功效，經臨床應用并證明，為目前良好的免疫功能增強劑，具有提高人體免疫功能，保護骨髓，腎上腺皮質和肝臟功能，適用于各種疾病引起的虛損、久病(肝硬化、慢性萎縮性胃炎、糖尿病、結核病等)、術后、產后患者的恢復；對癌癥病人放、化療期間有輔助治療作用，能明顯提高病人的遠期療效，促進正常功能的恢復。目前已有的相關劑型包括顆粒劑、膠囊劑、片劑等。本制劑由女貞子及黃芪兩味藥材組成，在現行質量標準中鑒別項和含量測定項僅控制黃芪藥材的質量，質量控制體系單一。現代藥理學表明，女貞子中紅景天苷及特女貞干具有免疫調節和抗氧化的作用，黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素及黃芪甲苷也有提高免疫的藥理作用。因此在現有質量標準的基礎上，增加多指標有效成分的含量測定，有利于該制劑的質量及臨床應用的穩定性。技術實現要素：本發明的目的在于，提供一種貞芪扶正制劑中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素四種有效成分的含量測定方法，以期能夠對制劑中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的含量進行快速、準確、高重現率、高回收率的測定。本發明完成前為發現對該制劑進行紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素四種成分同時測定的報道。本發明所述的的貞芪扶正制劑：黃芪藥材、女貞子藥材以2：1的重量比例加水煎煮三次，合并煎液，濾過，濾液濃縮，噴霧干燥，加適量輔料，制成各種劑型。本發明采用如下的技術方案：一種貞芪扶正制劑中多種有效成分的含量測定方法，以紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素為對照，以甲醇：水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％甲酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸水溶液＝5～100：95～0或者乙腈：水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％甲酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸水溶液＝5～100：95～0為流動相的高效液相色譜法。對制劑中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的含量測定按照如下步驟進行：(1)色譜條件與系統適應性試驗：以十八烷基硅烷合硅膠為填充劑；以甲醇：水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％甲酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸水溶液＝5～100：95～0或者乙腈：水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％甲酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸水溶液＝5～100：95～0為流動相；柱溫20～40℃；檢測波長為210～275nm；流速為0.8～1.2ml/min；理論塔板數以紅景天苷計不得少于3000。(2)對照品溶液的制備：取紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素對照品適量，加甲醇制成濃度分別含紅景天苷0.13mg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.14mg/ml、特女貞苷0.20mg/ml、芒柄花素0.015mg/ml的溶液，即得。(3)供試品溶液的制備：取貞芪扶正制劑5g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲或加熱回流30～60min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，回收溶劑至干，用甲醇溶解殘渣，定容于5ml量瓶中，濾過，取續濾液，即得。(4)測定法：分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。本發明所述的貞芪扶正制劑中紅景天苷(c14h20o7)含量不得少于0.16mg/g，特女貞苷(c31h42o17)含量不得少于0.8mg/g，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(c22h22o10)含量不得少于35μg/g，芒柄花素(c16h12o4)含量不得少于4μg/g。為確保本發明含量測定方法的科學性及合理性，申請人進行了一系列試驗研究和考察。一儀器與試藥(見表1)表1儀器與試藥二方法與結果1、色譜條件的選擇1.1柱溫的選擇對不同柱溫對各成分的分離情況進行考察，確定最佳柱溫，結果見表2表2不同柱溫對成分分離的影響柱溫(℃)25℃30℃35℃分離效果有色譜峰未分開分離效果較好有色譜峰未分開由表2的結果可知，柱溫30℃時分離效果最好。1.2流速的選擇對不同流速對各成分的分離情況進行考察，確定最佳流速，結果見表3表3不同流速對成分分離的影響由表3的結果可知，將流速設置為1ml/min可達到較好的分離效果。1.3流動相的選擇對不同流動相系統的分離效果進行考察，結果見表4表4不同流動相系統的分離效果由表4可知，采用乙腈-水流動相體系，所得到的色譜峰效果最好。2對照品溶液的制備取紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素對照品適量，加甲醇制成濃度分別含紅景天苷0.13mg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.14mg/ml、特女貞苷0.20mg/ml、芒柄花素0.015mg/ml的溶液，即得。3供試品溶液的制備取貞芪扶正制劑5g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲或加熱回流30～60min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，回收溶劑至干，用甲醇溶解殘渣，定容于5ml量瓶中，濾過，取續濾液，即得。通過對比超聲和回流兩種方法所得的成分含量結果表明，在相同條件下，二者成分的提出率相近，考慮超聲操作簡便的優點，選定超聲為提取方式。4檢測波長的選擇用二極管陣列檢測器(dad)以200～400nm波長進行掃描的對比各波長下紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的色譜圖，結果發現在檢測波長220nm時上述4個成分檢出效果較好，5標準曲線的制備紅景天苷精密取分別含紅景天苷0.2576mg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.2865mg/ml、特女貞苷0.5129mg/ml、芒柄花素30μg/ml的混合對照品溶液1、2、3、4、5ml于10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，進樣10μl，以所含對照品的量為x軸，峰面積為y軸，繪制回歸方程，結果見表5.表5回歸方程對照品方程r2紅景天苷y＝21.621x-10.4361毛蕊異黃酮葡萄糖苷y＝6.8725x-42.551特女貞苷y＝0.0321x+0.03270.9998芒柄花素y＝32.132x+0.03270.99986精密度試驗取上述對照品溶液10μl，重復進樣6次，計算紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的峰面積rsd值，結果紅景天苷rsd值為0.59％，毛蕊異黃酮葡萄糖苷rsd值為0.67％，特女貞苷rsd值為0.32％，芒柄花素苷rsd值為0.97％，表明該方法精密度良好。7穩定性試驗按照供試品制備方式制備樣品，吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、18、24h內進樣，計算得到各成分峰面積的rsd值為紅景天苷0.73％，毛蕊異黃酮葡萄糖苷46％，特女貞苷83％，芒柄花素苷1.03％，表明樣品溶液在24h內穩定性良好。8重復性試驗按照供試品制備方式平行制備6份樣品，各進樣10μl，記錄峰面積，計算各成分的含量及rsd值，結果得到紅景天苷含量為0.20mg/g，rsd為0.68％，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.042mg/g，rsd為0.95％，特女貞苷含量為1.01mg/g，rsd為1.02％，芒柄花素苷含量為53μg/g，rsd為0.76％，表明重復性良好。9加樣回收率試驗取已知含量的貞芪扶正制劑6份，分別精密加入紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素對照品，按供試品制備方式進行樣品溶液的制備，進行測定，計算各成分的平均回收率，結果見表6.表6加樣回收率試驗結果由表5可知，各成分的平均回收率均在95％～105～之間，rsd值均小于2％，說明本方法可行。10樣品的含量測定取10批貞芪扶正顆粒適量，精密稱定，分別按照供試品制備方式進行制備，按照所述色譜條件進行測定，計算10批制劑的紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的含量。結果見表7.表710批制劑的含量測定結果本發明與現有技術相比，通過采用高效液相色譜法對貞芪扶正制劑中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的同步含量進行測定，所述的質量表征較全面，方法專屬性強，精密度高，重復性好，回收率高，穩定性高，測量結果精確，可有效的控制制劑的質量，確保了相關制劑產品質量的穩定性及臨床的應用安全。具體實施方式本發明實施例1：貞芪扶正顆粒中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的含量測定方法：(1)色譜條件與系統適應性試驗：以十八烷基硅烷合硅膠為填充劑；以乙腈(a)-水(b)為流動相，梯度洗脫：0～10min，95％(a)～90％(a)，10～30min，90％(a)～78％(a)，30～40min，78％(a)～73％(a)，40～55min，73％(a)～45％(a)；柱溫35℃；檢測波長為220nm；流速為0.8ml/min；理論塔板數以紅景天苷計不得少于3000。(2)對照品溶液的制備：取紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素對照品適量，加甲醇制成濃度分別含紅景天苷0.13mg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.35mg/ml、特女貞苷0.2mg/ml、芒柄花素0.015mg/ml的溶液，即得。(3)供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：取貞芪扶正制劑5g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲或加熱回流30～60min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，回收溶劑至干，用甲醇溶解殘渣，定容于5ml量瓶中，濾過，取續濾液，即得。(4)測定法：分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。本發明實施例2：貞芪扶正膠囊中紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素的含量測定方法：(1)色譜條件與系統適應性試驗：以十八烷基硅烷合硅膠為填充劑；以乙腈(a)-0.02％甲酸水溶液(b)為流動相，梯度洗脫：0～10min，95％(a)～90％(a)，10～30min，90％(a)～78％(a)，30～40min，78％(a)～73％(a)，40～55min，73％(a)～45％(a)。；30℃；檢測波長220nmnm；流速為1ml/min；理論塔板數以紅景天苷計不得少于3000。(2)對照品溶液的制備：取紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷及芒柄花素對照品適量，加甲醇制成濃度分別含紅景天苷0.13mg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.35mg/ml、特女貞苷0.2mg/ml、芒柄花素0.015mg/ml的溶液，即得。(3)供試品溶液的制備：取貞芪扶正膠囊內容物5g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲或加熱回流30～60min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，回收溶劑至干，用甲醇溶解殘渣，定容于5ml量瓶中，濾過，取續濾液，即得。(4)測定法：分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。上述實例中的所有條件參數的任意組合，均可得到一致的含量測定結果。本發明所述的貞芪扶正制劑中紅景天苷(c14h20o7)含量不得少于0.16mg/g，特女貞苷(c31h42o17)含量不得少于0.8mg/g，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(c22h22o10)含量不得少于35μg/g，芒柄花素(c16h12o4)含量不得少于4μg/g。當前第1頁12