一種二氫楊梅素對映體的手性色譜分離分析方法
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發明屬于手性色譜分離技術領域，更具體地，涉及一種二氫楊梅素對映體的手 性色譜分離分析方法。
【背景技術】
[0003] 二氫楊梅素（Dihydromyricetin，見式I(a))是一種黃酮類化合物，其化學名為 (2R，3R)-3, 5, 7-三羥基-2- (3, 4, 5-三羥基苯基）苯并二氫吡喃-4-酮。1940年Kotake 和Kubota等首先從楝葉玉葡萄（A.Meliaefolia)的葉中分離得到。二氫楊梅素作為一種 不可多得的天然活性物質，具有抗炎抗過敏、抗氧化[現代食品科技，2014,（10) :36-41; 食品科學，2014,（20) :69-71]、止咳祛痰[中國民族醫藥雜志，1998,（3) :42-44]、鎮痛[福 建醫學雜學，1995,（4) :39-40]、抑菌[食品科技，2008,（4) :140-143]、降血脂[茶葉科學， 2007,（3) :221-225]、抗脂質過氧化[中國中藥雜志，2003,1188-1191]、抗腫瘤[中華中醫 藥學刊，2010,（9) :1914-1915]、保肝護肝[食品科學，2008,（11) :622-625]等生理活性，具 有很高的開發利用價值和應用前景。
[0004]式I 二氫楊梅素大量存在于蛇葡萄屬植物，如顯齒蛇葡萄、粵蛇葡萄、羽葉蛇葡萄、東北 蛇葡萄、光葉蛇葡萄等植物中，特別是在顯齒蛇葡萄植物的幼嫩莖葉中其含量可達30%以 上。目前，主要通過熱水提取后重結晶純化[現代食品科技，2009，（10) :1124-1128;食品 科技，2011，（6) :230-233 ;現代食品科技，2009,（8) :907-910]、乙醇浸泡輔助法[廣東化 工，2006,（10) :5-9]、微波萃取[廣州化工，2005,（2) :12-15 ;天然產物研究與開發，2005，
[5] :636-638]、低溫-超聲提取[中國發明專利申請201310391546.X]、微波逆流提取及膜 提取[中國發明專利申請201210229991. 1]、以水為萃取劑的逆流提取[食品科技，2004， (11) :192-194]、超臨界流體萃取法[沈露，天津科技大學碩士論文，2006]等方法從蛇葡萄 屬植物中提取和純化二氫楊梅素。
[0005] 天然的二氫楊梅素具有確定的絕對構型，文獻中常采用反相液相色譜法（即cls柱 或0DS柱，以乙腈/水或甲醇-水-磷酸為流動相）對二氫楊梅素產品進行純度和含量檢 測，不對絕對構型做進一步確認[Process Biochemistry，2006,41(3): 567-570 ;Journal of Chromatography A，2002,973(1) :217-220 ;湖南農業大學學報，2002，（1):32-34 ;中成 藥，2004,（3):210-212 ;廣東農業科學，2013,（19) :90-93]。然而，有文獻報道在沸水提 取、重結晶純化時，天然二氫楊梅素發生消旋化，（2R，3R)-二氫楊梅素和（2S，3S)-二氫 楊梅素(式I(b))同時析出，形成外消旋產物[Acta Crystallographic，2007，E63(ll): 04384和中國發明專利申請201510062355.8]。在中國發明專利申請201510062355.8,發明 人首次開發以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑、在甲醇-磷酸的流動相中添加手性添加劑 即β-環糊精的RP-HPLC拆分法對二氫楊梅素進行光學純度檢測，結果表明多種市售產品 的光學純度（e. e%)為0。
[0006] 由于二氫楊梅素分子中含有多個羥基和芳香環，易與手性選擇劑和硅膠產生較強 的氫鍵和Ji-Ji等相互作用，難被流動相洗脫和拆分，迄今未見直接采用手性色譜柱對二 氫楊梅素進行手性分析分離的研究報道。另一方面，手性化合物的立體構型可能對其生理 活性、毒性和臨床療效等產生極大影響。因此，在手性色譜柱上，開發一種二氫楊梅素對映 體的手性分離方法顯得尤為重要。
【發明內容】
[0007] 根據目前二氫楊梅素對映體手性拆分技術中的不足，本發明提供了一種二氫楊梅 素對映體的手性色譜分離分析方法。
[0008] 本發明的技術目的通過以下技術方案實現： 本發明提供一種二氫楊梅素對映體的手性色譜分離分析方法，包括如下步驟：二氫楊 梅素樣品溶解在流動相中，采用多糖衍生物手性固定相進行液相色譜分析分離； 所述流動相為正己烷和低級醇的混合溶液； 所述多糖衍生物手性固定相為涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）直鏈淀粉、三 ((S)- (α)_苯乙基氨基甲酰化）直鏈淀粉、三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）纖維素或三 (4-甲基苯基氨基甲酰化）纖維素手性固定相中的一種。
[0009] 發明人發現，以正己烷和低級醇作為流動相，在上述多糖衍生物手性固定相上，能 夠很好地實現二氫楊梅素對映體的手性色譜分離。
[0010] 更優選地，所述多糖衍生物手性固定相為涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化)直鏈 淀粉手性固定相。
[0011] 優選地，所述流動相中正己烷和低級醇的體積比為60~80 :40~20。
[0012] 優選地，所述流動相中正己烷和低級醇的體積比為80 :20。
[0013] 優選地，所述低級醇為乙醇或異丙醇。
[0014] 更優選地，所述低級醇為乙醇。 優選地，所述流動相中還含有不大于0.5% (體積百分數）的三氟乙酸。發明人發現，在 流動相中加入少量的三氟乙酸，可以加快二氫楊梅素的洗脫速度，提高選擇因子和分離度。
[0015] 更優選地，所述流動相中含有0. 1% (體積百分數）的三氟乙酸。
[0016] 優選地，所述二氫楊梅素樣品的濃度不大于1. 0mgmL、
[0017] 更優選地，所述二氫楊梅素樣品的濃度為0. 5mg·mL、
[0018] 優選地，所述的溫度為不大于30 °C。
[0019] 優選地，所述色譜條件中流動相的流速為1. 0mL·π?η\進樣體積為10μL，檢測 波長為290nm，色譜柱溫度為25°C〇
[0020] 更優選地，一種二氫楊梅素對映體的手性色譜分離分析方法，包括如下步驟：將二 氫楊梅素樣品溶解在流動相中，采用涂覆三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化)直鏈淀粉手性固定 相進行手性分離；所述流動相由正己烷、乙醇和三氟乙酸組成，其中，正己烷與乙醇的體積 比為80 :20,并添加總體積0. 1%的三氟乙酸。在上述色譜條件下，二氫楊梅素對映體的分 離度為1. 95,達到基線分離。
[0021] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 在本發明公開的涂覆型手性固定相材料上，結合所述的流動相，二氫楊梅素對映體實 現了良好的手性分離，色譜峰峰型、峰展寬和拖尾等得到改善。在優選的條件下，二氫楊梅 素對映體間的分尚度達到1. 95,選擇因子為1. 36。與文獻方法相比，本發明開發的手性分 離法需要在正相流動相條件下完成，分析分離速度快，可對二氫楊梅素產品進行快速分析 檢測。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明實施例2在涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）直鏈淀粉手性固定 相、25°C下，流動相為正己烷/乙醇/三氟乙酸（80 :20 :0. 1，v/v/v)、紫外檢測器(波長為 290nm)的條件下得到的二氫楊梅素樣品的HPLC譜圖。
[0023] 圖2為本發明實施例2在涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）直鏈淀粉手性固定 相、25°C下，流動相為正己烷/乙醇/三氟乙酸（80 :20 :0. 1，v/v/v)、旋光檢測器的條件下 得到的二氫楊梅素樣品的色譜圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對 本發明進行進一步說明，但不能理解為對本發明保護范圍的限制。
[0025] 除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設 備。
[0026] 實施例中，所用的涂覆三（3,5_二甲基苯氨基甲酰化)直鏈淀粉、三（（S)- (α)_苯 乙基氨基甲酰化）直鏈淀粉、三（3，5-二甲基苯氨基甲酰