新檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及癌癥和癌癥檢測領域。更具體地，本發明涉及對敏感指征例如腫瘤細 胞活性的新檢測方法。根據本發明的方法可用于對上皮源性癌，例如非小細胞肺癌，和膀胱 癌患者的管理。
【背景技術】
[0002] 在工業世界，癌癥是主要致死原因中的一個。為了改善病人護理，當前致力于發現 關于預測、治療反應的早期跡象和疾病進程的其它信息。為此感興趣的工具是癌癥生物標 記的使用，即表明體內存在癌癥的物質。生物標記是腫瘤或人體對存在的癌癥的特異反應 分泌的分子。理想的是，這種生物標記能夠在非侵入式收集的生物液體如尿液、血液或血清 中檢測。
[0003] 人們感興趣的一個領域是肺癌，它是世界范圍內最普遍和最致命的癌癥疾病。肺 癌致死的人比結腸、乳腺和前列腺癌的總和還多(WHO統計）。大約80-85%的肺癌患者有非 小細胞組織(NSCLC)。非小細胞肺癌(SCLC)占所有肺癌情況的約15-20%。大部分患者具有 處于晚期且無法手術的疾病。對于早期階段的NSCLC，切除作為僅有的有療效的治療方法仍 然是重要的。過去的十年間，人們廣泛研究了腫瘤標記物在肺癌中的價值。已經發現的對肺 癌具有臨床重要性的最普遍的生物標記是CEA、CYFRA、TPA、TPS和NSE。然而，靈敏性和專一 性的缺乏限制了癌癥生物標記在對肺癌進行檢查和早期診斷中的應用。對于疾病的預后評 價和過程檢測，癌癥生物標記顯得更加有效。
[0004] 所有真核細胞具有已知為中間絲的細胞質細胞骨架結構。細胞骨架網絡負責細胞 的機械完整性且在細胞過程如細胞分裂、運動和細胞間接觸中至關重要。目前，已經確認了 超過20種不同的細胞角蛋白，其中在簡單上皮細胞中細胞角蛋白8、18和19是最充足的。細 胞角蛋白是上皮細胞特有的且細胞角蛋白模式在正常細胞轉化成惡性細胞過程中通常保 留下來。
[0005] 檢測細胞角蛋白8、18和19上限定的表位的固相兩位點免疫放射分析（IRMA)是商 業上可獲取的（IDL Biothch，Bromma Sweden)，商標為]VlonoTotal?。將捕獲抗體，單克隆抗 體6D7(CK8)、3F3(CK18)和IDLC4(CK19)涂覆于塑料珠上。分析中使用多克隆 125I-標記抗體 作為示蹤劑。用γ計數器檢測放射活性且放射活性正比于細胞角蛋白抗原片段的濃度。 MonoTotal是設計為進行患者血清檢測的定量檢測。MonoTotal作為預后標記對于診斷、預 后，和對于監控患者的治療是有價值的。通過跟蹤患者的重復MonoTotal檢測，醫生能夠獲 取有關腫瘤細胞活性的關鍵信息。變化的MonoTotal標記水平表明腫瘤細胞活性發生變化， 且提高的水平指向腫瘤的存在。在患者管理和隨訪中該信息被認為特別重要，其中血液樣 品可用于監測治療和對腫瘤復發的早期檢測。當疾病仍限制于肺部時大約15%的肺癌患者 被確診，且早期檢測對于增加生存的可能是至關重要的。通過使用MonoTotal，醫生可以得 到疾病過程的指征信息，其以腫瘤細胞活性而不是傳統的腫瘤負荷檢測來測定。Mono Total能夠向醫生提供對診斷、建立預后、治療監測和患者隨訪中可靠的輔助信息。
[0006] 根據已公開研究，MonoTotal顯現出與患者的臨床反應非常相關。相較于肺癌患者 中的Cyfra，MonoTotal具有更高的靈敏度。在肺癌診斷中，不依賴于組織分型，MonoTotal的 整體靈敏度是約70-75 %，且特異性為95 %。非小細胞肺癌（NSCLC)的靈敏度更高。 MonoTotal與腫瘤細胞活性和疾病程度非常相關。此外，MonoTotal可預測疾病進程(無病期 間和整體存活率），且在NSCLC隨訪中是復發的早期標志。MonoTotal中的變化通常早于傳統 成像方法的復發的檢測。由于血清中細胞角蛋白的半衰期小于一天，所以在幾天內能夠進 行對治療反應的檢測。MonoTotal對于NSCLC是比程序化臨床實踐中目前使用的其他生物角 蛋白標記更靈敏的腫瘤標記。
[0007] 另一個感興趣的領域是膀胱癌，在世界范圍內其是男性和女性中常見的癌癥。超 過70%的情況都是非肌層浸潤性膀胱癌，但是很多患者發展成肌層浸潤性膀胱癌或轉移性 疾病。為提高對膀胱癌的預后，使用有效的方法進行早期檢測和常規隨訪對于患者而言是 重要的。
[0008] 非浸潤性膀胱癌檢測具有很多潛在應用，如幫助診斷復發，降低對侵入性檢測的 需求和檢測患者是否落入高風險范疇。UBC?免疫檢測（IDL Biotech)是一種非侵入性檢 測。
[0009] 然而，盡管當前市場上存在一些方法和檢測，但仍然存在對改進的診斷工具的需 求以從患者獲得關鍵臨床數據，避免能夠對疾病的早期癥狀進行有效檢測和對患者體內的 疾病狀況進行快速檢測時與使用多克隆抗體有關的弊端，例如通過血清或尿液分析。在該 領域中產品和過程滿足高質量標準，并根據標準化流程來開發、生產并供應到市場是至關 重要的。
[0010] 發明概述
[0011] 盡管可獲得的指征腫瘤細胞活性的方法運行的較好，但它取決于放射性標記抗體 的使用，其受限于特定規則和預防措施，對該方法的使用者產生了管理性和實踐性負擔。它 進一步取決于來自特定源的多克隆抗體的使用，如果來源不能提供多克隆抗體則會導致供 應問題。因此本發明人確認了開發不依賴于放射活性或多克隆抗體的特定源，但同時與現 存方法臨床上可兼容的方法的需求。
[0012] 根據本發明，使用一個、兩個或三個抗體固定于固相來捕獲來自液體樣品的細胞 角蛋白。標記的抗體與固相隨后接觸并使得能夠結合到固定的抗體-細胞角蛋白復合物，對 結合的抗體進行檢測。
[0013] 因此，本發明的一個方面涉及檢測樣品中至少兩種細胞角蛋白和/或其可溶性片 段的方法，所述細胞角蛋白選自細胞角蛋白8、18和/或19組成的組中，所述方法包括步驟：
[0014] -使所述樣品接觸其上已經固定了對細胞角蛋白8具有特異性的第一抗體，和/或 對細胞角蛋白18具有特異性的第二抗體，和/或對細胞角蛋白19的第一表位具有特異性的 第三抗體的固相；
[0015] -使所述樣品中的細胞角蛋白和/或其可溶性片段結合到所述第一、第二和/或第 三抗體從而形成復合物；
[0016] -使所述復合物與對細胞角蛋白8和18的二聚體具有特異性的第一標記抗體和對 細胞角蛋白19的第二表位具有特異性的第二標記抗體接觸；
[0017] -使所述標記抗體結合到所述復合物；
[0018]-檢測結合到所述復合物的所述標記抗體。
[0019]在另一方面，本發明涉及定量檢測選自細胞角蛋白8、18和19組成的組中的至少兩 種細胞角蛋白的可溶性片段的方法，包括根據前述方面的方法，和進一步的將對細胞角蛋 白8和18的二聚體具有特異性的第一標記抗體和任選的對細胞角蛋白19具有特異性的第二 標記抗體的量與細胞角蛋白8、18和/或19可溶性片段的量定量相關聯的步驟。
[0020] 在另一方面，本發明涉及實施根據上述任一方面方法的組配試劑盒，所述組配試 劑盒包括其上固定了對細胞角蛋白8具有特異性的第一抗體，和/或對細胞角蛋白18具有特 異性的第二抗體和/或對細胞角蛋白19具有特異性的第三抗體的固相;和對細胞角蛋白8和 18的二聚體具有特異性的第一標記抗體，和任選的，對細胞角蛋白19具有特異性的第二標 記抗體，優選的是在緩沖溶液中。
[0021] 本發明進一步的實施方式在以下的詳細說明和從屬權利要求中進行了限定。
[0022] 附圖的簡要說明
[0023] 圖1是如何實施根據本發明的方法的示意圖。
[0024]圖2是顯示了實施例2.1獲得的結果的圖。
[0025]圖3是顯示了實施例2.2獲得的結果的圖。
[0026]發明優選實施方式的詳細說明
[0027] 本發明人已經確認了對于制備新的或發現存在的抗體來優化檢測以避免現有技 術的缺陷，并保持與存在的檢測方法