一種利用野生大豆選育抗/耐草甘膦新種質的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于野生植物資源利用研究領域，具體涉及一種利用野生大豆選育抗/耐 草甘膦新種質的方法。
【背景技術】
[0002] 草甘膦是一種非常重要的有機磷類除草劑，它是一種施于葉片的、廣譜的、非選擇 性的除草劑，對于一年生和多年生雜草有極強的控制能力。
[0003] 轉基因大豆中轉入抗草甘膦基因，使得轉基因大豆對草甘膦的敏感性比較低，轉 基因大豆植株內的莽草酸途徑可以正常進行，從而表現出對草甘膦的抗性。自1994年轉基 因大豆在美國獲準商業化生產以來，全球轉基因大豆的種植面積迅猛增加。但是，由于抗 草甘膦轉基因大豆的大面積種植，以及草甘膦的長期、單一使用，導致田間抗草甘膦雜草的 出現頻率大大上升；而且，研究發現，在受到病蟲害以及過量的降雨或其它的除草劑的傷害 時，轉基因大豆植株將不能迅速分解草甘膦，從而出現藥害癥狀；同時抗性品種的篩選過程 中會有一些品種對草甘麟的耐生低于其他品種，從而導致轉基因大豆在噴施草甘膦后出現 藥害問題。
[0004] 野生大豆是栽培大豆的原始祖先種，自然條件下生長的野生大豆，在遺傳方面未 受到人為選擇的影響，因此很多豐富的功能基因并沒有因為人為選擇而丟失，這些基因可 能是大豆生產中所迫切需要的關鍵性基因，野生大豆資源中的高蛋白、多抗、廣適應性和 繁殖系數高的優良材料可以直接用于栽培大豆優質、抗病、高產育種研究，野生大豆資源 的遺傳多樣性對實現栽培大豆遺傳改良具有重要意義。（王克晶，李福山；我國野生大豆 (G.soja)種質資源及其種質創新利用，中國農業科技導報，2000,6(2) :69-72 :田清震，蓋 鈞鎰；野生大豆種質資源的研究與利用，植物遺傳資源科學，2000,4(1) :61-65)
[0005] 基于抗草甘膦轉基因大豆存在的缺陷以及野生大豆資源的遺傳多樣性，篩選自然 界中具有抗草甘膦的野生大豆資源并利用該資源進行品質改良就顯得尤為重要。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是利用具有草甘膦除草劑抗/耐性的野生資源改良現有的栽培大 豆品種，本發明提供了篩選、鑒定具有草甘膦除草劑抗/耐性的野生大豆植株的方法，并且 利用篩選到的資源開展種間雜交選育具有抗/耐草甘膦的新種質。
[0007] 本發明的技術方案：
[0008] -種利用野生大豆選育抗/耐草甘膦新種質的方法，所述選育抗/耐草甘膦新種 質的方法利用不同濃度梯度的草甘膦處理苗期野生大豆篩選出對草甘膦具有抗/耐性的 野生大豆，然后利用篩選出的具有抗/耐性的野生大豆與栽培大豆進行種間雜交，獲種間 雜交后代，對所述種間雜交后代的自交系進行草甘膦抗/耐性篩選結合表型篩選選育出對 草甘膦具有抗/耐性的新種質。
[0009] 進一步地，所述選育抗/耐草甘膦新種質的方法包括如下步驟：
[0010] (1)待鑒定野生大豆播種前的處理：在待鑒定野生大豆的種子籽粒中央背對子臍 處，去掉2mmX2mm大小的種皮，處理后的種子放入3-6°C冰箱待用；
[0011] (2)野生大豆對草甘膦抗性的鑒定：種植步驟（1)處理后的待鑒定野生大豆，采用 田間鑒定的方法鑒定所述待鑒定野生大豆對草甘膦的抗/耐抗性，設置10-15個草甘膦處 理濃度，每個所述草甘膦處理濃度對應設置一個試驗小區，在每個所述試驗小區內種植所 述待鑒定野生大豆，所述待鑒定野生大豆按穴種植，設置重復組以及空白對照組，種植的野 生大豆的兩片三出復葉完全展開時，向所述兩片三出復葉均勻噴施草甘膦；
[0012] (3)野生大豆草甘膦抗性級別的評價：步驟（2)處理后的第7天對噴藥后的野生 大豆植株的表型進行觀察，所述表型觀察的對象為枯葉的面積比例，并根據所觀察到的表 型確定野生大豆對草甘膦的抗性級別，并對不同處理濃度下所述待鑒定野生大豆的抗性級 別進行統計；
[0013] (4)抗性資源的確定：根據步驟（3)獲得的所述待鑒定野生大豆抗性級別數據， 進行頻數統計以及方差分析以確定用于篩選抗/耐草甘膦野生大豆的最適合的草甘膦處 理濃度；對所述最適合的草甘膦處理濃度下的所有待鑒定野生大豆的抗性進行多重比較分 析，以找出對草甘膦的抗/耐生與其他野生大豆相比差異顯著的野生大豆，將所述對草甘 膦的抗性/耐性差異顯著的野生大豆資源確定為具有抗/耐性的野生大豆
[0014] (5)種間雜交創制新種質：選擇合豐47號作為母本，以步驟（4)中篩選出具有抗/ 耐生的野生大豆為父本進行雜交育種，獲得F0代雜交粒，收集雜交粒進行保藏；
[0015] (6)種間雜交后代草甘膦抗性鑒定、表型篩選：繼續種植步驟（5)收獲的F0代雜 交粒，對自交后代F2直到F5按步驟（1)至步驟（5)所述方法進行草甘膦抗性篩選，并結合 后代表型篩選優良后代繼續進行自交繁殖，根據顯著性分析確定優良種間后代，篩選出抗 草甘膦新種質。
[0016] 進一步地，步驟（2)中所述噴施的草甘膦為41 %草甘膦異丙鹽水劑。
[0017] 進一步地，步驟（2)野生大豆對草甘膦抗性的鑒定中，設置10個草甘膦處理濃度， 所述設置的10個草甘膦處理濃度分別為〇ml/畝，25ml/畝，50ml/畝，100ml/畝，125ml/畝， 150ml/ 畝，175ml/ 畝，200ml/ 畝，225ml/ 畝，250ml/ 畝。
[0018] 進一步地，步驟（3)中所述根據表型確定野生大豆對草甘膦的抗性級別的方法是 建立抗性標準評價體系，所述抗性標準評價體系根據枯葉面積比例將待鑒定野生大豆的抗 性級別分為：〇級、1級、2級、3級、4級及5級，所述抗性級別從0級到5級對應的枯葉面積 比例為：〇-l〇. 〇%、l〇.l-20%、20.l-40%、40.l-70%、70. 1-90%、90. 1-100.0%。
[0019] 進一步地，步驟（5)中選擇黑農51號作為母本，以步驟（4)中篩選出的抗性野生 大豆資源為父本進行雜交育種，獲得代雜交粒，收集雜交粒進行保藏。
[0020] 進一步地，步驟（5)種間雜交創制新種質過程中，采用多功能授粉工具包和大豆 授粉去雄器進行。
[0021] 本發明的有益效果：
[0022] 本發明對野生大豆種皮進行部分處理，確保出苗一致；本發明利用草甘膦異丙鹽 (41 %水劑）處理篩選野生大豆資源，并通過設置多個草甘膦處理濃度，來深入了解野生大 豆資源對草甘膦抗性的抗性范圍，準確篩選抗性資源；確定了一個準確劃分草甘膦抗性級 別的評價標準，根據野生大豆藥害的表型變化分為6個抗性級別并賦值，根據方差分析確 定差異顯著的資源，從而大大增強了可靠性；采用本單位的多功能大豆授粉工具包（授權 號Z120140182009. 4)和大豆授粉去雄器（授權號Z1201420830748.x)進行野生大豆與栽 培大豆的雜交，提高了雜交的成功率。
[0023] 本發明確定了野生大豆資源抗性標準評價體系，創建了從野生資源評價篩選到利 用篩選的具有抗/耐性的野生大豆進行種間雜交選育抗/耐草甘膦新種質的方法，該方法 簡單、實用、高效，也適用于野生大豆其他性狀的研究。
【附圖說明】
[0024] 圖1.抗/耐草甘膦野生大豆的篩選評價及新種質創制的方法示意圖；
[0025] 圖2.野生大豆種皮處理示意圖；
[0026] 圖3.野生大豆苗期草甘膦處理后6個抗性級別野生大豆的表型示意圖；
[0027] 圖4.對野生大豆資源抗性級別的頻數統計分析圖以及不同濃度下抗性變化圖。
【具體實施方式】
[0028] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細描述。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用于解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0029] 相反，本發明涵蓋任何由權利要求定義的在本發明的精髓和范圍上做的替代、修 改、等效方法以及方案。進一步，為了使公眾對本發明有更好的了解，在下文對本發明的細 節描述中，詳盡描述了一些特定的細節部分。對本領域技術人員來說沒有這些細節部分的 描述也可以完全理解本發明。
[0030] 實施例1
[0031] -種利用野生大豆選育抗/耐草甘膦新種質的方法，所述選育抗/耐草甘膦新種 質的方法利用不同濃度梯度的草甘膦處理苗期野生大豆篩選出對草甘膦具有抗/耐性的 野生大豆，然后利用篩選出的具有抗/耐性的野生大豆與栽培大豆進行種間雜交，獲種間 雜交后代，對所述種間雜交后代的自交系進行草甘膦抗/耐性篩選結合表型篩選選育出對 草甘膦具有抗/耐生的新種質（如圖1所示）。
[0032] 所述選育抗/耐草甘膦新種質的方法包括如下步驟：
[0033] (1)待鑒定野生大豆播種前的處理（如圖2所示）：由于野生大豆要在惡劣的條件 下及貧瘠的環境中保護好種子，讓它們一直保持休眠狀態直至出現適合萌芽的條件，從而 實現長期的生存。其種皮堅硬通透性差，為使所有鑒定資源生長同步便于比較鑒定，需對野 生大豆進行處理，確保萌發出苗一致。每份資源選取籽粒均勻飽滿的種子20粒，在籽粒中 央背對子臍，去掉約2mmX2mm大小的種皮，注意不能種子的胚，處理后放入3-6°C冰箱保存 待用；
[0034] (2)野生大豆對草甘膦抗性的鑒定：
[0035] 種植步驟（1)處理后的待鑒定野生大豆，采用田間鑒定的方法鑒定所述待鑒定野 生大豆對草甘膦的抗/耐抗性，設置10個草甘膦處理濃度，每個所述草甘膦處理濃度對應 設置一個試驗小區，在每個所述試驗小區內種植所述待鑒定野生大豆，所述待鑒定野生大 豆按穴種植，每穴五粒，出苗后定苗一株，三次重復，設空白對照，種植的野生大豆的兩片三 出復葉完全展開時，向所述兩片三出復葉均勻噴施草甘膦；
[0036] (3)野生大豆草甘膦抗性級別的評價：步驟（2)處理后的第7天對噴藥后的野生 大豆植株的表型以及藥害癥狀進行觀察，根據所觀察到的表型結合抗性標準評價體系來確 定野生大豆對草甘膦的抗性級別，并統計不同處理濃度下不同所述待鑒定野