一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物育種領域，涉及一種植物同質突變體庫構建的方法，尤其涉及一種通過物理誘變劑(6°Co-y射線)快速創制矮生沿階草飽和基因同質突變體庫的方法。
【背景技術】
[0002]矮生沿階草(Oph1pogon japonicus f.nanus)屬百合科沿階草屬中的矮生沿階草種，具有強喜蔭性、四季常綠、耐寒、耐熱、再生能力強、觀賞性好、耐踐踏、管理容易等特點，適合于風景林下、建筑物遮蔭處及復層綠化帶下等特殊生境綠化、美化的草坪地被植物。矮生沿階草作為一種重要的無性繁殖植物，不但品種改良近年來不斷得到重視，其特有的一些生物學性狀如矮生性和強耐蔭性等也使得它成為尋找某些有重要利用價值的基因如矮生基因、耐蔭基因等基因資源發掘利用的典型材料。
[0003]分析鑒定基因的功能及基因之間的相互作用，基因對生長發育的影響，是功能基因組學的重點研究內容。目前盡管已經開發出了多種分析鑒定基因的新技術新方法，但最直接最有效的方法是構建飽和基因突變體庫，通過突變體分析鑒定基因的功能。所以突變體庫的構建是功能基因組學的研究基礎。目前模式植物擬南芥、水稻等作物均已構建了飽和突變體庫并進行了相關功能基因組學的研究，獲得了一批有重要價值的創新種質資源。
[0004]在眾多的物理誘變劑中，6°Co_y射線因其可在一個基因組上產生多個點突變，且分布均勻，特別是r射線主要引起DNA片段的缺失和染色體重排，特別適用于多個家族基因功能缺失的突變體庫的創建。尤其是其較小的突變群體便可獲得變異豐富的飽和突變體庫而成為一種應用廣泛，即高效又穩定的物理誘變劑。
[0005]同質突變體的獲得:最快速有效的方法就是通過單個突變細胞的組培再生獲得，由同質突變體獲得的變異性狀由于突變體無嵌合現象，所以是能夠穩定遺傳的，是組成同質突變體庫的基礎。但長期以來大部分植物組培再生都不是依賴于細胞水平上的再生，而是局限于個體或器官組織水平的再生。由多細胞組織器官誘變產生的再生植株后代，因其眾多細胞基因突變的差異性往往導致突變體嵌合現象很嚴重，性狀不穩定、重復性差、再生篩選時間延長，由于很難獲得同質突變體，從而導致育種效率下降等一系列弊端。
[0006]如何使一個單細胞發育成一棵完整植株，一直是許多植物組培再生的難題。目前的研究表明絕大多數植物體細胞胚起源于單細胞，體細胞胚胎發生途徑重演了合子胚形態發生的過程，所以體細胞胚再生途徑是再生種子來源、種苗脫毒快繁、誘導體細胞變異或基因轉化的理想的受體系統。
[0007]體細胞誘變、體細胞胚再生是快速獲得廣泛變異的同質突變體、避免嵌合體形成的理想方法，很容易在短時間內獲得大量的變異豐富的同質突變體，是構建表型可見并且遺傳穩定的突變體庫的基礎。因此體細胞物理誘變技術結合體細胞胚再生技術，是保證快速獲得r射線同質突變體庫的關鍵技術。
[0008]研究表明:突變體的篩選較簡單易行，已成為許多重要種質資源獲得的有效途徑，也是許多重要理論問題得以解決的前提。但突變體體細胞篩選結合體細胞胚再生的篩選方法有一定難度，目前報道還比較少見，它是定向同質突變體篩選成敗的關鍵。
[0009]目前國內外尚未發現利用遺傳背景相同的矮生沿階草體細胞通過r射線誘變處理，體細胞胚再生植株獲得變異豐富的同質突變體及通過突變體體細胞篩選結合體細胞胚再生快繁獲得定向同質突變體，以此構建矮生沿階草r射線飽和同質突變體庫的報道。因此本發明突破了以往大多數植物包括矮生沿階草:1)雖以物理誘變方法創制了突變體，但構建突變體庫的親本材料的遺傳背景不相同；2)突變體大多是以個體或器官組織發生途徑再生的植株，從而導致突變體嵌合現象非常嚴重，也因此導致篩選時間延長甚至是無意義的篩選；3)由于突變體嵌合現象很嚴重，導致產生的性狀很不穩定，延長了對突變體后代的篩選時間，且很難快速獲得同質突變體，也就難以通過r射線快速構建起遺傳穩定的變異豐富的及定向突變的飽和同質突變體庫。因此本項發明提供的一種快速構建矮生沿階草r射線飽和同質突變體庫的方法，不但為沿階草功能基因組學、遺傳育種提供了更多的種質資源，同時也為選育矮生沿階草新品種提供了最直接有效的突變體材料，具有重要的實用價值。
【發明內容】
[0010]發明目的:針對現有技術的不足，本發明主要解決的問題是提供一種體細胞r射線誘變、定向篩選及與體細胞胚再生相結合，快速構建矮生沿階草r射線飽和同質突變體庫的一種優化方法。
[0011]技術方案:為了解決上述技術問題，本發明提供了一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，該方法包括如下步驟:
[0012]I)高頻體細胞胚外植體材料準備:選取室外健康無病蟲害的矮生沿階草植株，取其幼嫩莖葉，無菌消毒后在無菌培養基中組培成無菌試管苗，取其莖葉基部0.5-1.0cm大小外植體，通過高頻體胚再生系統的培養，就會持續不斷地產生體細胞胚和胚狀體及完整地再生植株，以再生植株作為高頻體細胞胚外植體材料來源；
[0013]2)早期體細胞胚外植體的培養:將上述具高頻體細胞胚再生能力的外植體切取其葉、莖基部0.5cm大小組織塊，放在體胚發生誘導培養基上25-28°C無菌室暗培養7_10d，此時大部分體細胞為單細胞時期，稱作早期體細胞胚，以此作為誘變劑處理材料；
[0014]3)物理誘變劑準備:包括6°Co- γ射線源準備及輻射劑量的設置；6°Co- γ射線源由江蘇里下河地區農業科學研究所提供；
[0015]4)早期體細胞胚外植體的γ射線處理:將早期體細胞胚外植體分成8組，用于8個不同輻射劑量的處理；
[0016]5)體細胞胚分化培養:將經γ射線誘變處理過的早期體細胞胚外植體，重新放回無菌室在溫度25-28°C下暗培養50-60d，中間繼代一次，有利于體細胞胚分化，可見外植體上大大小小生長發育出幾十個早期突變胚狀體；常溫暗培養可保證快速獲得具廣泛基因變異的遺傳穩定的同質飽和突變體材料。
[0017]6)同質突變胚狀體快繁増殖培養:將上述早期突變胚狀體切成0.5cm大小塊，分別編號轉接于體細胞胚快繁增殖培養基，放在25-28°C光下培養50-60d，中間繼代一次，可獲得大量成熟的同質突變胚狀體；
[0018]7)同質突變胚狀體的篩選及快繁増殖培養:將上述快繁的各類同質突變胚狀體取出一部分，切成0.5cm大小塊，分別編號繼續轉接于體細胞胚快繁增殖培養基，放入5_8°C低溫無菌培養箱中弱光下(500-8001x)培養25_30d，之后再繼代轉入25_28°C光下(1500-20001x)培養25-30d，可獲得抗冷性較強的成熟同質突變胚狀體；
[0019]8)成熟同質突變胚狀體再生植株:是將上述快繁増殖的具豐富變異的成熟突變胚狀體及抗冷性強的成熟突變胚狀體均分別編號轉接于植株再生培養基中，在無菌室溫度25-28°C光下培養20-25d，獲得具根、莖、葉完整的同質突變體再生植株；
[0020]9)同質突變體再生植株煉苗移栽:當根長生長到1-1.5cm時，將各突變體株系分別編號移栽到花盆，選擇輕型基質，放置在溫室大棚內，自動間歇噴霧裝置澆水；成活率可達100%。揭去培養瓶的封口膜，在室內煉苗I?2d，用鑷子小心取出小苗，洗凈根上附著的培養基，移栽到裝有輕型基質(泥炭:蛭石=1:1)的花盆中，放入溫室溫度為24°C?26°C，適當遮蔭，或將小苗放到苗床下，自動間歇噴霧裝置澆水。
[0021]10)田間突變體庫建立:60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系移栽到室外林下或田間區試圃，分別編號，記載相關性狀，在同質突變體生長發育的各階段進行突變體鑒定、篩選，以此建立起沿階草γ射線飽和同質突變體庫，用于后續沿階草選擇育種和基因功能組學等方面的研究。由于小苗生長旺盛，對移栽大田的條件要求也不高，極易種植，小苗的成活率可達100%。
[0022]其中，所述步驟3)中輻射劑量設置:設置為0.0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy 8個不同處理；
[0023]其中，所述步驟3)中6°Co_ γ射線輻射劑量為20Gy。
[0024]其中，所述無菌培養基培養為1/2MS+2.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+(λ 7%瓊月旨。
[0025]其中，所述誘導培養基為MS+0.2mg/L BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸 +30g/L 鹿糖 +3.5g/L phytagelo
[0026]其中，所述高頻體胚再生系統的培養:是指將初生胚狀體轉入高頻體細胞胚培養基上光下培養50-60d，中間繼代一次，就會持續不斷大量地產生次生胚狀體即體細胞胚。
[0027]其中，所述高頻體細胞胚培養基為MS+2mg/L BA+0.5mg/L NAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel ο
[0028]其中，所述步驟6)中體細胞胚快繁增殖培養基為MS+2mg/L BA+0.2mg/L NAA+40g/L鹿糖+3.5g/L phytagel，光照強度為1500_20001x，光照時間為每天10_14小時，即可保證快速繁殖各種突變胚狀體又可獲得相應成熟的同質突變胚狀體。
[0029]其中，所述步驟8)中植株再生培養基為l/2MS+20g/L白糖+0.7%瓊脂。
[0030]有益效果:與現有技術相比，本發明的優點在于:選擇在眾多的物理誘變劑中，60Co-Y射線這種即高效又穩定、又方便使用的物理誘變劑，利用其可在一個基因組上產生多個分布均勻的點突變，主要以引起DNA片段的缺失和染色體重排，特別適用于多個家族基因功能缺失的突變體庫的創建，尤其是其較小的突變群體便可獲得變異豐富的飽和突變體庫特性，及其所獲得的突變體不涉及轉基因事件，安全性高等優點；同時克服了以往60Co- γ射線誘變方法創制的突變體遺傳背景不相同、嵌合現象嚴重、性狀不穩定、重復性差、再生篩選時間延長，難以獲得飽和和定向同質突變體，育種效率低等一系列弊端。本發明利用遺傳背景相同的矮生沿階草體細胞通過6°Co-y射線誘變結合體細胞胚再生，及體細胞篩選結合體細胞胚再生的復合誘變技術，獲得了在生育期、綠期、開花期、葉色、株型、抗性等方面不同類型的變異豐富的飽和突變體庫，特別是還定向獲得了耐冷性強的基因資源，即豐富了矮生沿階草基因庫，種質資源還可應用于品種選育之中。所以此項發明提供的一種快速構建矮生沿階草r射線飽和同質突變體庫的方法，不但為沿階草功能基因組學、遺傳育種等問題的深入研究奠定了基礎，同時也為選育抗寒性強的矮生沿階草新品種提供了最直接有效的同質突變體材料，具有重要的理論意義和應用價值。
【附圖說明】
[0031]圖1胚性單細