一種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法及其在育種中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于抗病育種技術領域，具體涉及一種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法及 其在大豆育種中的應用。
【背景技術】
[0002] 由大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆 生產中的一種毀滅性土傳病害。該病已在我國多個省份都有發生。大豆疫霉在大豆所有生 育期均可以侵染大豆，引起根腐、莖腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田塊減產10% -30%， 嚴重地塊可達60% -90%，甚至造成絕產。目前全世界每年因大豆疫病造成的經濟損失大 約為10億美元（Tyler，2007)。
[0003]目前，研究人員一般通過下胚軸創傷接種法鑒定大豆對大豆疫病的抗性。采用下 胚軸接種法，只能在幼苗期進行，且接種后感病材料死亡，導致后續實驗無法開展。這一缺 點在雜合大豆抗疫病植株F2群體的鑒定中尤為明顯，會造成群體的損失，并無法進行重復 鑒定。鑒于此，有必要發展研究新的方法以鑒定大豆對大豆疫病的抗性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是為了提高大豆對大豆疫病抗性的鑒定效率，及避免傳統鑒定方法 會造成雜合抗病植株F2群體損失的缺陷，而提供一種新的鑒定大豆對大豆疫病抗性的方 法及其在大豆育種中的應用。本發明的鑒定方法操作簡便，成本低廉，節約時間，且可以進 行重復實驗，同時不會損失待鑒定的實驗材料，避免傳統方法會造成實驗材料群體性丟失 的弊端。
[0005] 本發明提供的技術方案之一是：一種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法，其包括如 下步驟：
[0006] (1)接種體的制備：將大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)菌 株接種于CA培養基、V8培養基或利馬豆培養基，暗培養使菌株復壯，之后將富含菌體的培 養基處理碎，即得接種體；
[0007] ⑵接種大豆植株材料：將步驟⑴所得的接種體盛裝于檢測容器中，選取待檢大 豆植株剛剛平展的綠色帶柄葉片，將葉柄插入所述檢測容器中的接種體中；
[0008] (3)暗培養：將步驟⑵中接種了大豆材料的檢測容器置于濕潤的密閉空間中 暗培養后判斷結果，所述密閉空間的溫度為22~27°C，所述密閉空間的相對濕度為90~ 100%;所述判斷結果的判斷標準為，當培養3~5天后，若葉片和葉柄保持綠色或葉柄上病 斑的長度小于等于1. 5cm，則待檢大豆植株為抗病植株，若葉柄上病斑的長度大于1. 5cm， 則待檢大S?植株為感病植株。
[0009] 本發明中，步驟（1)為接種體的制備。
[0010] 其中，所述大豆疫霉菌株為本領域常規所述的大豆疫霉菌株，包括各種不同毒力 基因型的菌株，如PsMCl、Ps41-l和PsUSAR2等。
[0011] 所述的CA培養基為本領域常規所述，其具體配方為：以1L體積計，其中包括200g 胡蘿卜和20g瓊脂。
[0012] 所述的V8培養基為本領域常規所述，其具體配方為：以1L體積計，其中含有果汁 200g，CaC033g，瓊脂20g，其余為蒸餾水，pH5. 8。
[0013] 所述的利馬豆培養基為本領域常規所述，其配制方法為：以1L體積計，取利馬豆 粉60g，加水1000ml，在60°C水浴lh，雙層紗布過濾去渣，上清液補足至1000ml，加入瓊脂 20g，煮沸后持續沸騰數分鐘，冷卻即得。
[0014] 在將大豆疫霉菌株接種于CA培養基之前，較佳地還包括對所述大豆疫霉菌株進 行分離和純化的步驟（S):將大豆疫霉菌株在CA培養基上暗培養7~10d，培養溫度為22~ 27°C(優選25°C)，之后接種感病大豆品種的幼苗恢復毒力，在植株發病后進行病原菌的分 離和純化，將得到的大豆疫霉菌株用于后續接種。
[0015] 步驟（1)中所述暗培養的溫度較佳地為22~27°C(優選25°C);所述暗培養的 時間較佳地為7~10天。
[0016] 步驟（1)中所述的將富含菌體的培養基處理碎指采用本領域任何常規可行的方 法將富含大豆疫霉菌菌體的CA培養基處理碎（最好至均勻）即可，如可以攪拌至細碎均 勻，也可以搗碎。較佳地，所述處理為使用豆漿機將富含菌體的培養基處理碎。
[0017] 本發明中，步驟（2)為接種大豆植株材料。
[0018] 其中，所述的檢測容器可以是本領域任何常規的容器，如EP管、小試管、離心管等 均可，優選2~5mL的離心管。
[0019] 所述的待檢大豆植株剛剛平展的綠色帶柄葉片可以是植株合適部位的任意葉片， 只要其健康、幼嫩且呈綠色即可，優選具有長度大于4cm的葉柄的綠色復葉。如本領域常 規，所述綠色帶柄葉片在接種前，葉柄部位一般需要進行外植體消毒，以防雜菌感染。較佳 地，所述綠色復葉在接種前，去掉部分小葉（優選去掉側生小葉，保留中間小葉）。
[0020] 在葉柄插入所述檢測容器中的接種體中后，較佳地，使用濕脫脂棉在容器口對葉 柄進行固定，所述固定同時將去掉小葉形成的創口隔絕空氣。
[0021] 本發明中，步驟（3)為暗培養。
[0022] 其中，所述密閉空間可以是本領域常規的無菌空間，如可以選用規格較大的塑料 盒。在具體操作中，則可以先將步驟（2)接種有大豆植株材料的檢測容器（如離心管）置 于冷凍盒，再將冷凍盒放置在大塑料盒中，最后將大塑料盒置于高溫高濕環境（優選25°C， 90~100%RH)進行暗培養。
[0023] 所述鑒定方法的一較佳實例包括如下步驟：
[0024] (1)接種體的制備：將大豆疫霉菌株在CA培養基上暗培養7~10d，培養溫度為 25°C，之后接種感病大豆品種的幼苗恢復毒力，在植株發病后進行病原菌的分離和純化，將 純化得到的大豆疫霉菌株接種于CA培養基，暗培養7~10d，之后將富含菌體的培養基用豆 漿機打碎至均勻，即得接種體；
[0025] (2)接種大豆植株材料：將步驟⑴所得的接種體盛裝于2mL去蓋離心管中，選取 待檢大豆植株具有長度大于4cm的葉柄的剛剛平展的綠色復葉，將所述復葉兩側的小葉去 除，將葉柄插入所述離心管中的接種體中，用濕潤的脫脂棉在離心管口對葉柄進行固定同 時將去除小葉形成的創口隔絕空氣；
[0026] (3)暗培養：將步驟（2)中接種了大豆材料的離心管放入冷凍盒中，將所述冷凍盒 放置在底部鋪有濕潤海綿的密封塑料盒中，將所述密封塑料盒置于25°C暗培養4天判斷結 果，所述判斷結果的判斷標準為，當培養4天后，若葉片和葉柄保持綠色或葉柄上病斑的長 度小于等于1. 5cm，則待檢大豆植株為抗病植株，若葉柄上病斑的長度大于1. 5cm，則待檢 大S?植株為感病植株。
[0027] 本發明提供的技術方案之二是：前述鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法在大豆育種 中的應用。
[0028] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0029] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0030] 本發明的積極進步效果在于：
[0031] 本發明的鑒定方法有下述優勢：1)不影響大豆植株的生長；2)操作簡便，成本低 廉；3)實驗條件可控性高，實驗所占空間很小，耗時短；4)可以在大豆絕大部分生育期進行 鑒定實驗，能夠進行重復實驗；5)能夠同時開展對多個大豆疫霉菌株的鑒定；6)不會損失 待鑒定的實驗材料，避免傳統方法會造成實驗材料群體性丟失的弊端。因此，本發明的鑒定 方法在大豆育種中具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0032] 圖1為實施例1中選取的綠色帶柄復葉將兩側小葉去除后的示意圖，以及將去除 了小葉后的葉柄插入接種體后的示意圖。
[0033]圖2為實施例1在接種葉柄暗培養4天后觀察感病或抗病情況的示意圖，其中，左 邊葉片為已確定是抗病的植株的狀態，右邊葉片為已確定是感病的植株的狀態。
【具體實施方式】
[0034] 以下實施例用于說明本發明，但并不用來限制本發明的范圍。本發明中，除特殊說 明的之外，所有設備、試劑和材料均為常規市售可得。
[0035]實施例1一種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法[0036] (1)大豆疫霉接種體的制備
[0037] 大豆疫霉菌株（ATCCX_ 52696?)保存在CA培養基上，實驗時將菌株轉入含 有15ml1. 5 %瓊脂的CA培養基的培養皿中，25 °C黑暗培養7-10天，培養環境相對濕度 為 90 ~100 %。接種感病品種Williams(該品種在"GeneticAnalysisofSoybean PlantIntroducti