onswithResistancetoPhytophthorasojae，GordonSG，et al.Phytopathology, 2007Jan;97 (1) : 106-12"中有披露，為常規大豆感病品種）幼苗恢復 毒力，植株發病后進行病原菌的分離和純化，用于接種。接種前一周，將菌株轉入含有15ml 的含有1. 5 %瓊脂的CA培養基的培養皿中，25 °C黑暗培養7-10天，培養環境相對濕度為 90~100%。接種時，用九陽豆漿機將含有菌絲的培養基打碎配制接種體，分裝到5ml的注 射器中，接種備用。
[0038] (2)接種大豆植株材料：剪取大豆植株上部一個健康幼嫩復葉，留4cm葉柄，將兩 邊的小葉剪去（如圖1所示）。
[0039] ⑶暗培養
[0040] 用注射器在去蓋的2ml離心管底部注入0. 5ml的接種體，將大豆葉片的葉柄插入 接種體中，在離心管口處，用濕潤的棉花包裹葉柄（如圖1所示），起固定和保濕作用。然后 將離心管放入100格的冷凍盒中。將冷凍盒放入底部鋪有濕潤海綿的大塑料盒中，盒上部 用一層塑料布密封緊，放入25°c培養室保濕培養4天后進行病情調查（如圖2所示）。記 錄葉片和葉柄狀態，若葉柄已感染，記錄葉柄上病斑的長度。
[0041] 選取13個大豆品系（如表1所示）進行上述實驗，前期的下胚軸創傷接種法 (Schmitthenner,A.F. , &Bhat,R.G. (1994).UsefulmethodsforstudyingPhytophthora inthelaboratory.SpecialCircular-OhioAgriculturalResearchandDevelopment Center, (143))表明，其中7個品系對3個大豆疫霉菌株均表現出抗性，豫豆25對PsUSAR2 和PsMCl表現出抗性，而新黃豆只對PsMCl表現出抗性，還有4個品系為對3個大豆疫霉菌 株均表現出感病，葉柄接種法的鑒定結果與之相符。統計學分析后，得出如下判斷感病和抗 病的標準為：在步驟（3)暗培養4天后，若葉片和葉柄均保持綠色，或葉柄病斑長度不超過 1. 5cm則為抗病植株（R);若葉柄變褐變軟，且病斑長度大于1. 5cm則為感病植株（S)。
[0042] 表1各大豆品系以下胚軸創傷接種法和葉柄接種法進行鑒定的結果
[0043]
[0044]
[0045] 實施例2 -種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法
[0046] (1)大豆疫霉接種體的制備
[0047] 大豆疫霉菌株保存在胡蘿卜汁瓊脂（CA)培養基上，實驗時將菌株轉入含有15ml 的1. 5%瓊脂的CA培養基培養皿中，22°C黑暗培養7-10天，接種感病品種Williams幼苗恢 復毒力，植株發病后進行病原菌分離和純化，用于接種。接種前一周，將菌株轉入含有15ml 的含有1. 5%瓊脂的CA培養基的培養皿中，27°C黑暗培養7-10天。接種時，用九陽豆漿機 將含有菌絲的培養基打碎配制接種體，分裝到5ml的注射器中，接種備用。
[0048] (2)接種大豆植株材料：剪取大豆植株上部一個健康幼嫩復葉，留4cm葉柄，將兩 邊的小葉剪去。
[0049] ⑶暗培養
[0050] 用注射器在去蓋的2ml離心管底部注入0. 5ml的接種體，將大豆葉片的葉柄插入 接種體中，在離心管口處，用濕潤的棉花包裹葉柄，起固定和保濕作用。然后將離心管放入 1〇〇格的冷凍盒中。將冷凍盒放入底部鋪有濕潤海綿的大塑料盒中，盒上部用一層塑料布密 封緊，放入25°C培養室保濕培養4天后進行病情調查。記錄葉片和葉柄狀態，若葉柄已感 染，記錄葉柄上病斑的長度。
[0051] 根據實施例1得出的判斷感病和抗病的標準判斷結果，在這些植株生長一段時間 后采樣進行重復實驗，結果表明重復實驗的結果和前期的檢測結果一致，同實施例1中同 樣地，這些被測植株在前期以下胚軸創傷接種法測得的結果和在本實施例中以葉柄接種法 所得結果一致。這表明本發明的鑒定方法及其判斷標準準確可靠。
[0052] 雖然，上文中已經用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發明作了詳盡的描 述，但在本發明的基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易 見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護 的范圍。
【主權項】
1. 一種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法，其特征在于，其包括如下步驟： (1) 接種體的制備：將大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)菌株接 種于CA培養基、V8培養基或利馬豆培養基，暗培養使菌株復壯，之后將富含菌體的培養基 處理碎，即得接種體； (2) 接種大豆植株材料：將步驟（1)所得的接種體盛裝于檢測容器中，選取待檢大豆植 株剛剛平展的綠色帶柄葉片，將葉柄插入所述檢測容器中的接種體中； (3) 暗培養：將步驟（2)中接種了大豆材料的檢測容器置于濕潤的密閉空間中暗培養 后判斷結果，所述密閉空間的溫度為22~27°C，所述密閉空間的相對濕度為90~100% ; 所述判斷結果的判斷標準為，當培養3~5天后，若葉片和葉柄保持綠色或葉柄上病斑的長 度小于等于I. 5cm，則待檢大豆植株為抗病植株，若葉柄上病斑的長度大于I. 5cm，則待檢 大S?植株為感病植株。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在將大豆疫霉菌株接種于CA培養基、V8 培養基或利馬豆培養基之前，還包括對所述大豆疫霉菌株進行分離和純化的步驟（S):將 大豆疫霉菌株在CA培養基上暗培養7~10d，培養溫度為22~27 °C，之后接種感病大豆品 種的幼苗恢復毒力，在植株發病后進行病原菌的分離和純化，將得到的大豆疫霉菌株用于 步驟⑴接種。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述暗培養的溫度為22~ 27°C;所述暗培養的時間為7~10天。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述的將富含菌體的培養基處 理碎為使用豆漿機將富含菌體的培養基處理碎。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的檢測容器為2~5mL的離心管。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中所述的綠色帶柄葉片為具有長 度大于4cm的葉柄的綠色復葉。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述綠色復葉在接種前，去掉部分小葉。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，在葉柄插入所述檢測容器中 的接種體中后，使用濕脫脂棉在容器口對葉柄進行固定。9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其包括如下步驟： (S)大豆疫霉菌株的分離和純化：將大豆疫霉菌株在CA培養基上暗培養7~10d，培養 溫度為25°C，之后接種感病大豆品種的幼苗恢復毒力，在植株發病后進行病原菌的分離和 純化，得到純化的大豆疫霉菌株； (1) 接種體的制備：將純化得到的大豆疫霉菌株接種于CA培養基，暗培養7~10d，之 后將富含菌體的培養基用豆漿機打碎成勻漿，即得接種體； (2) 接種大豆植株材料：將步驟（1)所得的接種體盛裝于2mL去蓋離心管中，選取待 檢大豆植株上剛剛平展的具有長度大于4cm的葉柄的綠色復葉，將所述復葉兩側的小葉去 除，將葉柄插入所述離心管中的接種體中，用濕潤的脫脂棉在離心管口對葉柄進行固定同 時將去除小葉形成的創口隔絕空氣； (3) 暗培養：將步驟（2)中接種了大豆材料的離心管放入冷凍盒中，將所述冷凍盒放置 在底部鋪有濕潤海綿的密封塑料盒中，將所述密封塑料盒置于25°C暗培養4天判斷結果， 所述判斷結果的判斷標準為，當培養4天后，若葉片和葉柄保持綠色或葉柄上病斑的長度
【專利摘要】本發明提供一種鑒定大豆對大豆疫病抗性的方法及其在育種中的應用。所述方法包括步驟：將大豆疫霉菌株接種于CA培養基、V8培養基或利馬豆培養基，暗培養使菌株復壯，之后將富含菌體的培養基處理碎，即得接種體；(2)接種大豆植株材料：將步驟(1)所得的接種體盛裝于檢測容器中，選取待檢大豆植株剛剛平展的綠色帶柄葉片，將葉柄插入所述檢測容器中的接種體中；(3)暗培養：將步驟(2)接種了大豆材料的檢測容器置于濕潤的密閉空間中暗培養后判斷結果。本發明的鑒定方法操作簡便，成本低廉，節約時間，且可以進行重復實驗，同時不會損失待鑒定的實驗材料，避免傳統方法會造成實驗材料群體性丟失的弊端。
【IPC分類】A01H3/04, A01H3/00
【公開號】CN105165604
【申請號】
【發明人】朱振東
【申請人】中國農業科學院作物科學研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月15日