一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，具體涉及一種通過兩次脫分化產生愈傷組織并將愈傷組織熱處理后再分化、最終高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法。
【背景技術】
[0002]非洲菊(CferAera jamesonii Bolus)別名扶郎花、太陽花，為菊科多年生草本植物，原產于南非德瓦士蘭地區，后引入英國，現在世界各地廣泛栽培。非洲菊性喜冬季溫暖，夏季涼爽的氣候，花朵大、清秀挺拔、飄灑俊逸、花色艷而不妖、麗若云霞、嬌媚高雅、爽心悅目，給人以瀟灑柔和、恬淡寧靜之感。非洲菊常用來切花插瓶，若配以腎藏、文竹等綠色觀葉植物，更令人神往心醉，非洲菊也很適宜用作盆栽觀賞，是點綴案頭、櫥窗、裝飾客廳的佳品，觀賞價值較高，在設施條件下能四季供花，現已躋身世界市場暢銷切花之列，是國內外名貴的鮮花品種，是世界著名的五大切花之一，以其獨特的魅力風靡全球。
[0003]非洲菊為異花傳粉植物，自交不孕，其種子后代必然會發生變異，變異類型普遍表現為花梗變細，變軟，花形變小，切花價值大大降低。非洲菊種子壽命極短，發芽率低，其發芽率幾乎不到30%，而且，采用種子繁殖，營養生長期長，開花遲。非洲菊常用分株繁殖，但每株每年僅可分出5-6個新株，無法滿足產業化生產的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代積累，從而造成非洲菊品種退化嚴重。
[0004]組織培養技術是非洲菊商品化生產的主要繁殖方式，既可在短期內大量生產優良種苗，也可用于生產脫毒苗，防止種質退化。20世紀70年代后，國內外相繼展開了對非洲菊組織培養和快速繁殖的研究，非洲菊采用離體培養方法進行快繁，短期內就可得到大量整齊的種苗，建立高效再生體系，有利于種子資源的保存以及優良品種推廣；組培苗還具有生長勢強、優質、高產、縮短繁殖周期、提高繁殖系數、方便運輸等特點，因而非洲菊離體快繁具有廣闊的開發前景。
[0005]非洲菊的離體快繁技術日益成熟，但是非洲菊的脫毒技術還有待進步，脫毒效率低、操作繁瑣已經嚴重阻礙了非洲菊品質的提高和生產的需求，因此研究和建立一種既能保持品種優良特性和較高的繁殖系數，又能脫除培養材料中的病毒病原的有效方法，對于防止病毒的進一步擴散，減少種植者的風險具有重要的現實意義。目前非洲菊受到很多病毒的為害，這些病毒的存在嚴重影響組培苗的生產和出口貿易，因此解決非洲菊組培苗的完全脫毒問題十分重要。目前對植物病毒病害的防治尚無有效的辦法，而從源頭防止植物帶病毒可能會是最有效的辦法之一，因此通過莖尖組織培養結合熱處理技術進行脫毒已廣泛用于控制病毒病，但是脫毒效率還有待進一步提高。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有非洲菊脫毒技術存在的不足，提供一種可持續化、易操作且能夠規模化生產的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，該方法解決了現有脫毒技術的脫毒不徹底、操作繁瑣的難題，能夠滿足工廠化脫毒生產的需要。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案解決的:
一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:該方法步驟如下:
1)采集非洲菊嫩葉，脫分化產生愈傷組織；
2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗；
3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織；
4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗；
5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的非洲菊脫毒種苗。
[0008]該方法的詳細步驟如下:
1)采集非洲菊嫩葉，脫分化產生愈傷組織:
采集生長至現蕾期的健康無病的非洲菊的嫩葉，自來水洗凈，流水沖洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞內加數滴吐溫-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒攪動，用無菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，用孔直徑4_的打孔器打孔，將打下的葉片接種到愈傷誘導培養基上26-28°C條件下暗培養，15-20天后產生淡綠色米粒狀的愈傷組織；
2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗:
將生長至大米粒大小、帶有少量外植體的愈傷組織轉移到培養箱中熱處理，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上光培養，20-30天后愈傷組織分化出不定芽，將再生出來的高度Icm以上的芽轉接至生根培養基26-28°C條件下光培養成健壯的組培苗；
3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織:
待組培苗生長至6cm-10cm，剝取0.4-0.7cm大小的莖尖生長點接種到莖尖誘導愈傷培養基上，在26-28°C條件下暗培養30-45天，誘導出愈傷組織；
4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗:
再次將莖尖愈傷組織進行熱處理，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上，26-28°C條件下光培養20-30天后誘導出不定芽，然后轉接入生根培養基，40-60天后可得到非洲菊幼苗；
5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的非洲菊脫毒種苗:
隨機抽取8-10只完成了步驟4)的的非洲菊葉片，進行RT-PCR反轉錄病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗。
[0009]非洲菊品種選為陽光海岸或玲瓏。
[0010]步驟I)中用于誘導非洲菊葉片產生愈傷組織的愈傷誘導培養基為:MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3% 蔗糖 +6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0011]步驟2)中將將愈傷組織繼續誘導出不定芽的不定芽誘導培養基為:1/2MS +5mg/L6-BA+0.1ΝΑΑ+3%蔗糖+5.0g/L植物凝膠；所述的將愈傷組織誘導成苗的培養基的光照條件為:光照強度為1500-2000LUX，光周期為14h光/1h暗。
[0012]步驟2)和步驟4)中熱處理方法為:在38°C _42°C高溫處理6h_8h、然后26°C _28°C低溫處理10h-12h交替進行2-3循環。
[0013]步驟3)中用于誘導莖尖產生愈傷組織的培養基配方為:MS+2.0mg/L 6-BA+lmg/LNAA+0.5mg/L KT+3% 蔗糖，pH 為 5.8。
[0014]步驟4)中將愈傷組織誘導出不定芽的不定芽誘導培養基配方為:MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L KT+2% 蔗糖，pH 為 5.8 ;生根培養基配方為:l/2MS+0.lmg/L IBA+1.5% 蔗糖，pH 為 5.8ο
[0015]步驟4)中將莖尖愈傷組織誘導不定芽的光照條件為:光照強度為1500-2000LUX，光周期為16h光/8h暗。
[0016]步驟5)病毒檢測的病毒種類為番茄黑環病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和煙草脆裂病毒。
[0017]本發明所述的一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，是發明人經過仔細研究、大量實驗驗證后獲得的優選結果，相比現有技術，本發明的創新點為:
本發明通過采用綜合脫毒技術，即兩次愈傷組織誘導、愈傷組織熱處理脫毒、莖尖脫毒相結合的方法，有效的克服了脫毒材料較多、脫毒操作流程繁瑣、脫毒效率低下等難題，能夠高效獲得非洲菊脫毒幼苗。
[0018]本發明創造性的采用了愈傷組織熱處理的脫毒方法，采用本發明的愈傷組織熱處理后，切割掉褐化部分，培養熱處理后褐化程度不明顯的愈傷部分，可有效去除掉愈傷組織攜帶的病毒，大大提高了脫毒效率，而且避免了無菌操作，操作簡單。
[0019]本發明的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法采用莖尖誘導成愈傷，提高了非洲菊的種性，又進一步脫除了非洲菊病毒，該方法流程簡單、容易操作，故易于形成規模化生產的脫毒種苗，適宜推廣使用。
【附圖說明】
[0020]圖1是陽光海岸脫分化產生愈傷組織的結果圖；
圖2是陽光海岸愈傷組織再分化出不定芽的結果圖；
圖3是無菌條件下剝離莖尖操作的示意圖；
圖4是陽光海岸生根培養60天的結果圖；
圖5是本技術路線下離體快繁獲得大量陽光海岸脫毒苗的結果圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0022]一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，該方法的詳細步驟如下:1)采集非洲菊品種陽光海岸或玲瓏的嫩葉，脫分化產生愈傷組織:采集生長至現蕾期的健康無病的非洲菊的嫩片，自來水洗凈，流水沖洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞內加數滴吐溫-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒攪動，用無菌水沖洗4_5次，濾紙吸干，用孔直徑4_的打孔器打孔，將打下的葉片接種到愈傷誘導培養基(愈傷誘導培養基配方為:MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3% 蔗糖 +6.0g/L 瓊脂，pH 為 8)上 26_28°C條件下暗培養，15-20天后產生淡綠色米粒狀的愈傷組織；2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗:將生長至大米粒大小、帶有少量外植體的愈傷組織轉移到培養箱中，38°C -42°C熱處理處理6h-8h、然后26°C _28°C低溫處理10h-12h，交替進行2-3循環。然后切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(不定芽誘導培養基配方為:1/2MS +5mg/L6-BA+0.1ΝΑΑ+3%蔗糖+5.0g/L植物凝膠，pH為5.8)上26-28°C條件下光培養，光培養的光照強度控制為1500-2000Lux、光周期控制為14h光/1h暗，20-30天后愈傷組織分化出不定芽，將再生出來的高度Icm以上的芽轉接至生根培養基培養成健壯的組培苗；3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織:待組培苗生長至6cm-10cm，剝取0.4-0.7cm大小的莖尖生長點接種到莖尖誘導愈傷培養基上(莖尖誘導愈傷培養基配方為:MS+2.0mg/L 6-BA+lmg/L NAA+0.5mg/L KT+3%蔗糖，pH為 5.8)，在26-