一種百日草脫毒種苗的高效擴繁方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，具體涉及一種能夠在短時間內擴繁出大量優良百日草脫毒種苗的擴繁方法，屬于園藝栽培技術領域。
【背景技術】
[0002]百日草，菊科，百日草屬，原產北美、墨西哥及南美等地，因節節升高，花越開越繁茂，獲諸多美名，如狀元紅、火球花、百日菊、步步高等。百日草喜溫暖，不耐寒，耐干旱，宜陽光充足，在長日照條件下舌狀花增多。百日草花期長，花量大，每株自初花至霜凍開30-40朵。優良品種多為千層瓣，花色極其豐富，為夏秋季花壇常用花卉，百日草花姿十分優美，色彩鮮艷多變，深受人們喜愛，為阿拉伯聯合酋長國國花。墨西哥是百日草的原始產地，對百日草的育種研究也居世界之首，不斷向各國推出新品種，成為墨西哥花卉出口的支柱產業。百日草在我國南北方也廣泛栽培，有“庶民之花”的美稱，為綠化主栽品種之一。
[0003]目前我國已成為世界上最大的花卉種子潛在消費市場，草花種子每年的銷售量都以20%的增幅上升。百日草雖然在我國各大中城市普遍栽培，但百日草種子幾乎被美國公司所控制，種子依賴國外進口，且價格昂貴，而進口種子為Fl代，后代易出現形、色分離的情況，而采用分株繁殖每株每年僅可分出5-6個新株，無法滿足產業化生產的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代積累，從而造成百日草品種退化嚴重。
[0004]組織培養技術是目前百日草商品化生產的主要繁殖方式，既可在短期內生產優良種苗，也可用于生產脫毒苗，防止種質退化。2近年來，國內外相繼展開了對百日草組織培養和快速繁殖的研究，百日草采用離體培養方法進行快繁，短期內就可得到大量整齊的種苗。然而，目前百日草脫毒之后的快繁方法存在誘導率較低、誘導苗質量差且多弱苗、幼苗增殖效率低、苗移栽成活率低等問題，嚴重制約了百日草種苗工廠化、規模化生產。因此，建立健全簡單經濟的百日草脫毒種苗擴繁技術，對促進百日草脫毒種苗工廠化、規模化生產，對百日草優良品種的推廣具有廣闊的市場前景。
【發明內容】
[0005]為解決目前百日草脫毒苗擴繁方法存在的誘導率較低、誘導苗質量差且多弱苗、幼苗增殖效率低、苗移栽成活率低等問題，本發明提供了一種百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，通過建立健全了培養程序、培養條件和培養組分的配比，提高了誘導苗的質量和增殖效率、移栽成活率，從而建立了高品質和高數量快繁體系。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案解決的:
一種百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:該方法步驟如下:
1)百日草脫毒苗前處理:將百日草脫毒苗清洗干凈并表面消毒，在無菌條件下切取葉柄和花托，移入裝有配制好的不定芽誘導培養基廣口瓶中；
2)不定芽的誘導:將接種有脫毒苗外植體的不定芽誘導培養基廣口瓶置于消毒處理過的培養室中光培養，誘導出不定芽； 3)切割不定芽繼代增殖:在無菌條件下將不定芽切下，移入裝有增殖培養基的廣口瓶中培養，得到大量百日草幼苗；
4)煉苗:逐步采用增強培養光照、降低培養溫度的方法進行煉苗；
5)水培生根處理:將煉苗后的脫毒試管苗從廣口瓶中取出，保留原有根系，再將組培苗栽于水培盤中的栽培板上，水培盤中加入生根營養液；
6)水培壯苗:生根培養7天后，倒掉生根營養液，加入壯苗營養液；
7)移栽:將脫毒苗移栽到消過毒的基質上，置于室外自然光下生長。
[0007]該方法的詳細步驟如下:
1)百日草脫毒苗前處理:
將百日草脫毒苗先用自來水反復沖洗，用毛刷蘸取洗潔精洗一遍后接著用超純水沖洗干凈，用70%酒精浸泡15s，再用無菌水沖洗兩次，0.1%升汞內加數滴吐溫20溶液浸泡5min，用無菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，將百日草脫毒苗的葉柄和花托移入裝有不定芽誘導培養基的廣口瓶中；
2)不定芽的誘導:
為防百日草脫毒苗在生產過程中被病毒再浸染，培養室先經過消毒，消毒劑選用40%甲醛10ml/m3、高錳酸鉀5g/m3，對整個培養室進行熏蒸2小時，熏蒸后，再采用75%乙醇擦拭培養架進行表面消毒，然后將接種有百日草脫毒苗外植體的不定芽誘導培養基廣口瓶置于消毒處理過的培養室中光培養，培養室溫度控制為26土 1°C，以熒光燈為光源，光照強度控制為1500-2000LX，光周期控制為光14h/暗10h，25-30天誘導出不定芽；
3)切割不定芽繼代增殖:
在無菌條件下將誘導2-3cm的不定芽從外植體上完整的切下，轉接到裝有增殖培養基的廣口瓶中，培養室溫度控制為24± 1°C、光照強度控制為1500-2000LX、光周期控制為光12h/暗12h下培養，培養15-25天后可得到大量百日草幼苗；
4)煉苗:
篩選5-8cm的百日草脫毒試管苗，轉移到光照強度為2500-35001X的條件下，3_5天后，將培養溫度降低為20-22°C，再過3-5天，打開廣口瓶封口，繼續煉苗3-5天；
5)水培生根處理:
為減少轉接對脫毒試管苗根系帶來的傷害，轉接前向廣口瓶內加入少量水，并用鑷子輕輕攪動培養基，以免把苗子倒出時損傷根，試管苗倒出后洗凈根上的培養基，移栽到裝有生根培養液的水培盤中的栽培板上，栽培密度1000-1200苗/m2，株距2_3cm，行距2_3cm，水培器皿用盆底長X寬=44 X 32cm，盆高=15cm的塑料盆作為栽培盆，每盆放2L營養液，并有定植孔間距為2cm-3cm的栽培板漂浮在營養液上，將脫毒苗上方搭上一層透明的塑料薄膜，使其處于溫度22-25°C、濕度多90%、光照強度為2000-30001x的清潔的溫室內環境生長；
6)水培壯苗:
生根培養7天后，脫毒苗根系基本發育完全，此時，撤掉塑料薄膜，倒掉生根營養液，給幼苗澆施壯苗營養液；
7)移栽:
當百日草脫毒苗長到12-15cm時，移栽到消過毒的基質上，移栽密度為行距15cm、株距10cm，塑料薄膜覆蓋保濕，10-15天后逐步除去薄膜，置于室外自然光下生長。
[0008]百日草品種選為芳菲I號、芳菲2號和芳菲3號。
[0009]步驟I)和2)中的不定芽誘導培養基的配方為:MS+0.5mg/L KT+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L GA+0.3g/L CH +3% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0010]步驟3)中的增殖培養基配方為:MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+3%蔗糖+6.5g/L瓊月旨，pH為5.8。
[0011]步驟5)和 6)中的生根培養液配方為:500mg/L KNO3, 500mg/L NH4NO3,92.5mg/LMgSO4.7H20，173mg/L Ca (NO3)2.4H20，150mg/L KH2PO4, 32mg/L KCl，17mg/L MnSO4.7H20，19mg/L Na2-EDTA, 14mg/L FeSO4.7H20，2.2mg/L MnSO4.4H20，0.8mg/L ZnSO4.7H20，0.8mg/L H3BO3,0.4mg/L KI，50mg/L 肌醇，lmg/L 甘氨酸，0.0Smg/LVBj, 0.05mg/LVB6，混合制成生根營養液。
[0012]步驟5 )和6 )中的生根培養液的另一種可選配方為:950mg/L KNO3，825mg/LNH4NO3,85mg/L KH2PO4, 220mg/LCaCl2.2H20，185mg/L MgSO4.7H20，19mg/L Na2-EDTA, 14mg/L FeSO4.7H20，I lmg/L MnSO4.4H20，0.4mg/L KI，3.lmg/L H3BO3,4.3mg/L ZnSO4.7H20，
0.125mg/L Na2MoO4,0.0125mg/L CuSO4,0.0125mg/L CoCl2.6H20，50mg/L 肌醇，lmg/L 甘氨酸，0.0SmgAVB1，0.05mg/LVB6,混合制成生根營養液。
[0013]步驟6)中的壯苗營養液配方為:850mg/L KNO3, 750mg/L NH4NO3,165mg/LMgSO4.7H20，75mg/L KH2PO4, 200mg/L CaCl2.2H20，20mg/L Na2-EDTA, 15mg/L FeSO4.7H20，10.5mg/L MnSO4.4H20，4.25mg/L ZnSO4.7H20，3.0mg/L H3BO3, 0.4mg/L KI，0.12mg/LNa2M0O4.2H20，0.012mg/L CoCl2.6H20，0.012mg/L CuSO4.5H20，0.4mg/L KI，30mg/L 肌醇，
0.5mg/L甘氨酸，0.0Smg/LVB^0.05mg/LVB6，混合制成壯苗營養液。
[0014]步驟7)中的消過毒的基質成分為等體積比例的草炭、珍珠巖、蛭石。
[0015]本發明的有益效果:
(1)本發明消毒方法簡單、有效，外植體消毒效果好，外植體的污染率降低為5%以下；
(2)本發明解決了現有技術誘導率較低、增殖效率低的缺點，不定芽誘導率比平均水平提高30%左右；不定芽增殖效率比平均水平提高30%左右；最終擴繁效率提高了 70%左右；
(3)本發明解決了現有技術種苗質量差、弱苗多的缺點，獲得的種苗質量高，弱苗或死苗率降低到僅有1%左右；
(4)本發明苗移栽成活率比現有技術大大提高，移栽成活率達到99%以上。
【附圖說明】
[0016]圖1是芳菲2號不定芽誘導的結果圖；
圖2是芳菲2號不定芽增殖的結果圖；
圖3是本技術路線離體快繁獲得大量優質芳菲2號種苗的結果圖。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例結合附圖進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。
[0018]實施例1 本實施例的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，實驗品種選為芳菲2號，實施時間為2014年-2015年，芳菲2號脫毒苗前處理、植株再生及煉苗在連云港市振興花卉園進行，組培苗移栽在連云港市東辛農場花卉試驗基地內進行，詳細步驟如下:
I)芳菲2號脫毒苗前處理:
將芳菲2號脫毒苗先用自來水反復沖洗，用毛刷蘸取洗潔精洗一遍后接著用超純水沖洗干凈，用70%酒精浸泡15s，再用無菌水沖洗兩次，0.1%升汞內加數滴吐溫20溶液浸泡5min，用無菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，將芳菲2號脫毒苗的葉柄和花托移入裝有不定芽誘導培養基(配方為:MS+0.5mg/L KT+1.5mg/L 6-BA+0.4mg/L GA+0.3g/L CH +3%蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8)的廣口瓶中，為對比本發明不定芽誘導培養基的效果，同時選擇了另外一種不定芽誘導培養基，培養基配方分別為:MS+0.2mg/L KT+2.0mg/L BA+0.5mg/L GA+30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH為5.8 (對比文件來自于曹彤彤等《百日草組織培養技術的研究》)
2)芳菲2號不定芽的誘導:
為防脫毒苗在生產過程中被病毒再浸染，培養室先經過消毒，消毒劑選用40%甲醛10ml/m3、高錳酸鉀5g/m3，對整個培養室進行熏蒸2小時，熏蒸后，再采用75%乙醇擦拭培養架進行表面消毒，然后將接種有芳菲2號脫毒苗外植體的不定芽誘導培養基廣口瓶置于消毒處理過的培養室中光培養，培養室溫度控制為26±1°C，以焚光燈為光源，光照強度控制為1800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，培養26天后觀察到誘導出了不定芽，如圖1，統計不定芽誘導率，本發明芳菲2號不定芽誘導率達到74.4%，顯著高于對比例