28°C條件下暗培養30-45天，誘導出愈傷組織；4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗:再次將莖尖愈傷組織進行熱處理，熱處理方法同步驟2)，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(不定芽誘導培養基配方為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+2%蔗糖，pH為5.8)上，光照強度為1500-2000LUX、光周期為16h光/8h暗的光照條件、26_28°C的溫度條件下培養20-30天后誘導出不定芽，然后轉接入生根培養基(生根培養基配方為:1/2MS+0.lmg/L IBA+1.5%蔗糖，pH為5.8)，40-60天后可得到非洲菊幼苗；5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的非洲菊脫毒種苗:隨機抽取8-10只完成了步驟4)的的非洲菊葉片，進行RT-PCR反轉錄病毒檢測，檢測的病毒種類為番茄黑環病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和煙草脆裂病毒，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗。
[0023] 實施例一
一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，該方法的詳細步驟如下:
1)采集非洲菊品種陽光海岸的嫩葉，脫分化產生愈傷組織:采集生長至現蕾期的健康無病的非洲菊的嫩葉，自來水洗凈，流水沖洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞內加數滴吐溫-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒攪動，用無菌水沖洗5次，濾紙吸干，用孔直徑4mm的打孔器打孔，將打下的葉片接種到愈傷誘導培養基(愈傷誘導培養基配方為:MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3% 蔗糖 +6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.8)上 27°C下暗培養，18 天后我們觀察到產生了淡綠色米粒狀的愈傷組織，如圖1所示；
2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗:將生長至大米粒大小、帶有少量外植體的愈傷組織轉移到恒溫培養箱中，40°C熱處理處理7h、然后27°C低溫處理llh，交替進行3次循環，然后切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(不定芽誘導培養基配方為:1/2MS +5mg/L6-BA+0.1ΝΑΑ+3%蔗糖+5.0g/L植物凝膠，pH為5.8)上27°C下光培養，光培養的光照強度控制為1800Lux、光周期控制為14h光/1h暗，23天后可以觀察到愈傷組織分化出不定芽，如圖2所示，將再生出來的高度Icm以上的芽轉接至生根培養基培養成健壯的組培苗；
3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織:待組培苗生長至6cm-10cm，剝取0.4-0.7cm大小的莖尖生長點接種到莖尖誘導愈傷培養基上(莖尖誘導愈傷培養基配方為:MS+2.0mg/L 6-BA+lmg/L NAA+0.5mg/L KT+3% 蔗糖，pH 為 5.8)，莖尖剝離操作如圖 3 所示，然后將莖尖在27°C下條件下暗培養30-45天，誘導出愈傷組織；
4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗:再次將莖尖愈傷組織進行熱處理，熱處理方法同步驟2)，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(不定芽誘導培養基配方為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+2% 蔗糖，pH 為 5.8)上，光照強度為 1800Lux、光周期為16h光/8h暗的光照條件、27°C溫度條件下培養，22天后有不定芽誘導出現，然后轉接入生根培養基(生根培養基配方為:l/2MS+0.lmg/L IBA+1.5%蔗糖，pH為5.8)，40天左右誘導出早期非洲菊幼苗，到60天后幼苗基本誘導齊，如圖4 ;
5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測:隨機抽取10只完成了步驟4)的的非洲菊葉片，進行RT-PCR反轉錄病毒檢測，檢測的病毒種類為番茄黑環病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和煙草脆裂病毒，未發現病毒殘留，表明非洲菊幼苗已徹底脫毒，將該幼苗離體擴繁，獲得大量脫毒幼苗，如圖5。
[0024]本發明通過采用綜合脫毒技術，即兩次愈傷組織誘導、愈傷組織熱處理脫毒、莖尖脫毒相結合的方法，有效的克服了脫毒材料較多、脫毒操作流程繁瑣、脫毒效率低下等難題，能夠高效獲得非洲菊脫毒幼苗。本發明創造性的采用了愈傷組織熱處理的脫毒方法，采用本發明的愈傷組織熱處理后，切割掉褐化部分，培養熱處理后褐化程度不明顯的愈傷部分，可有效除掉愈傷組織攜帶的病毒，大大提高了脫毒效率，而且減少了無菌操作，操作簡單。本發明的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法采用莖尖誘導成愈傷，提高了非洲菊的種性，又進一步脫除了非洲菊病毒，該方法流程簡單、容易操作，故易于形成規模化生產的脫毒種苗，適宜推廣使用。
[0025]以上實施例僅為說明本發明的技術思想，不能以此限定本發明的保護范圍，凡是按照本發明提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本發明保護范圍之內；本發明未涉及的技術均可通過現有技術加以實現。
【主權項】
1.一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:該方法步驟如下: 1)采集非洲菊嫩葉，脫分化產生愈傷組織； 2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗； 3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織； 4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗； 5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的非洲菊脫毒種苗。2.根據權利要求1所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:該方法的詳細步驟如下: 1)采集非洲菊嫩葉，脫分化產生愈傷組織: 采集生長至現蕾期的健康無病的非洲菊的嫩葉，自來水洗凈，流水沖洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞內加數滴吐溫-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒攪動，用無菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，用孔直徑4_的打孔器打孔，將打下的葉片接種到愈傷誘導培養基上26-28°C條件下暗培養，15-20天后產生淡綠色米粒狀的愈傷組織； 2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗: 將生長至大米粒大小、帶有少量外植體的愈傷組織轉移到培養箱中熱處理，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上光培養，20-30天后愈傷組織分化出不定芽，將再生出來的高度Icm以上的芽轉接至生根培養基26-28°C條件下光培養成健壯的組培苗； 3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織: 待組培苗生長至6cm-10cm，剝取0.4-0.7cm大小的莖尖生長點接種到莖尖誘導愈傷培養基上，在26-28°C條件下暗培養30-45天，誘導出愈傷組織； 4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗: 再次將莖尖愈傷組織進行熱處理，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上，26-28°C條件下光培養20-30天后誘導出不定芽，然后轉接入生根培養基，40-60天后可得到非洲菊幼苗； 5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的非洲菊脫毒種苗: 隨機抽取8-10只完成了步驟4)的的非洲菊葉片，進行RT-PCR反轉錄病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗。3.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:非洲菊品種選為陽光海岸或玲瓏。4.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟O中用于誘導非洲菊葉片產生愈傷組織的愈傷誘導培養基為:MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3% 蔗糖 +6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.8。5.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟2)中將將愈傷組織繼續誘導出不定芽的不定芽誘導培養基為:1/2MS +5mg/L6-BA+0.1ΝΑΑ+3%蔗糖+5.0g/L植物凝膠；所述的將愈傷組織誘導成苗的培養基的光照條件為:光照強度為1500-2000Lux，光周期為 14h 光 /1h 暗。6.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟2)和步驟4)中熱處理方法為:在38°C-42°C高溫處理6h_8h、然后26°C _28°C低溫處理10h-12h交替進行2-3循環。7.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟3)中用于誘導莖尖產生愈傷組織的培養基配方為:MS+2.0mg/L 6-BA+lmg/L NAA+0.5mg/L0+3%蔗糖，？!1為5.8。8.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟4)中將愈傷組織誘導出不定芽的不定芽誘導培養基配方為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/LKT+2%蔗糖，pH為5.8 ;生根培養基配方為:l/2MS+0.lmg/L IBA+1.5%蔗糖，pH為5.8。9.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟4)中將莖尖愈傷組織誘導不定芽的光照條件為:光照強度為1500-2000LUX，光周期為16h光/8h 暗。10.根據權利要求1或2所述的高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于:步驟5)病毒檢測的病毒種類為番茄黑環病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和煙草脆裂病毒。
【專利摘要】本發明公開了一種高效獲得非洲菊脫毒幼苗的方法，其特征在于：該方法步驟如下：1）采集非洲菊嫩葉，脫分化產生愈傷組織；2）將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗；3）進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織；4）再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗；5）隨機抽取步驟4）中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即非洲菊脫毒種苗，若不合格需重復1）到4）步，直到獲得合格的非洲菊脫毒種苗。本發明通過兩次脫分化產生愈傷組織并將愈傷熱處理后再分化，最終得到非洲菊脫毒幼苗，解決了現有脫毒技術的脫毒不徹底、操作繁瑣的難題，能夠滿足工廠化脫毒生產的需要。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165609
【申請號】
【發明人】不公告發明人
【申請人】無錫南理工科技發展有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月10日