一種蜈蚣蘭組培快繁方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組織培養研究領域，具體涉及一種蜈蚣蘭組培快繁方法。
【背景技術】
[0002]娛蟻蘭(Cleiso-stamascolopendrifolium (Makino) Garay)屬蘭科隔距蘭屬，是國家II級保護植物，主要分布于我國中東部的河南、浙江、福建、重慶等13個省、直轄市，附生于海拔1000米的山澗兩側的巖石或樹皮上。蜈蚣蘭全株可入藥，有清熱解毒、潤肺止咳和利水通淋等功效，具有廣泛的藥用價值，主要用于治療氣管炎、膽囊炎、咽喉炎、急性扁桃體炎、慢性副鼻竇炎、小兒驚風等癥，在湖北武當山地區被民間作為還陽草入藥，認為對某些疾病患者有起死回生的作用。因其分布區域較窄、生境獨特、種群較小，易受人類活動影響等原因，影響了該物種資源的開發和利用，組織培養技術為蜈蚣蘭種質資源的保存和開發開辟了新途徑。由于蜈蚣蘭植株內具有內生真菌，在組織培養初代培養時內生菌絲迅速蔓延，嚴重影響組培快繁體系的建立，至今沒有蜈蚣蘭組培快繁方法的研究報道。
【發明內容】
[0003]本發明提供一種蜈蚣蘭組培快繁方法，目的在于解決現有技術存在的問題，降低內生菌的污染率，其特征在于包括以下步驟:
(O外植體采集及消毒:春季剪取長2?3cm帶莖尖的蜈蚣蘭莖段，剝去葉片，用清水沖洗I?2h，在超凈工作臺上用75%乙醇溶液消毒40S，用0.1%升汞溶液消毒8min，用無菌水沖洗5?6次；
(2)芽誘導培養:將經步驟(I)消毒后的莖段切下莖尖，接種至芽誘導培養基，進行叢生芽誘導培養，培養25?35d得到叢生芽，培養條件為:光照10?12 h/d，光照強度1500?2000Lx，溫度 25 ±2 cC ;
(3)增殖培養:將步驟(2)芽誘導培養得到的叢生芽切取單芽，接種至增殖培養基進行增殖培養，培養30?40d后切取生長健壯的單芽，備用，培養條件為:光照12?16 h/d，光照強度2000?2500Lx，溫度25±2°C ；
(4)壯苗培養:將步驟(3)增殖培養中獲得的單芽接種至壯苗培養基進行壯苗培養，培養15?20d后得到無根苗，培養條件為:光照12?16 h/d,光照強度2000?2500Lx，溫度25±2°C ；
(5)生根培養:將步驟(4)壯苗培養中獲得的無根苗接種至生根培養基進行生根培養，培養25?35d得到生根的試管苗，培養條件為:光照10?12 h/d，光照強度1500?2000Lx，溫度 25 ±2 cC ;
(6)煉苗移栽:將步驟(5)生根培養得到的試管苗，挑選苗高6?8cm的壯苗帶瓶移至溫度25±2°C、空氣相對濕度75?80%、光強2000?2500Lx的環境下，逐漸打開瓶蓋，煉苗2?3天，然后取出組培苗，洗凈培養基，栽至溫度16?26°C，空氣相對濕度80%?85%，光強2000?2500Lx環境下的苗床中，苗床基質由泥炭土、珍珠巖、松樹皮按體積比3:1:1混合而成。
[0004]前述的一種蜈蚣蘭組培快繁方法，其中步驟(2)所述的芽誘導培養基成分為:MS+6-BA3.0 ?5.0mg/L+IAA0.5 ?0.8mg/L+ 鹿糖 25 ?30g/L+ 卡拉膠 8.0 ?10.0g/L+AC1.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+CM10%，pH 為 5.5 ?6.5。
[0005]前述的一種蜈蚣蘭組培快繁方法，其中步驟(3)所述的增殖培養基成分為MS+6-BA4.0 ?6.0mg/L+NAA0.6 ?1.0mg/L+ 鹿糖 25 ?30g/L+ 卡拉膠 8.0 ?10.0 g/L+AC1.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+CM10%，ρΗ5.5 ?6.5。
[0006]前述的一種蜈蚣蘭組培快繁方法，其中步驟(4)所述的壯苗培養基成分為MS+GA31.0 ?2.0mg/L+NAA0.3 ?0.5mg/L+ 蔗糖 25 ?30g/L + 卡拉膠 8.0 ?10.0g/L +ACl.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+ 椰汁 15%，ρΗ5.5 ?6.5。
[0007]前述的一種蜈蚣蘭組培快繁方法，其中步驟(5)所述的生根培養基成分為:MS+IBA1.0 ?3.0 mg/L+蔗糖 25 ?30g/L + 卡拉膠 8.0 ?10.0 g/L +50% 多菌靈 I ?1.5g/L+ 香焦泥 10%，pH5.5 ?6.5。
[0008]本發明的有益效果體現在:提供了蜈蚣蘭的組織培養和快速繁殖技術，通過培養基中添加多菌靈可有效抑制蜈蚣蘭內生菌及其他雜菌的污染，本方法重復性良好，培養周期短，有效增殖率高，生根苗生長健壯、整齊，生根率為85%?90%，移栽成活率為94%?98%，可進行大規模商品化育苗生產，對于保護蜈蚣蘭種質資源及其開發利用具有重要意義。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
(O外植體采集及消毒:春季剪取長2?3cm帶莖尖的蜈蚣蘭莖段，剝去葉片，用清水沖洗I?2h，在超凈工作臺上用75%乙醇溶液消毒40S，用0.1%升汞溶液消毒8min，用無菌水沖洗5?6次；
(2)芽誘導培養:將經步驟(I)消毒后的莖段切下莖尖，接種至芽誘導培養基，進行叢生芽誘導培養，芽誘導培養基成分為:MS+6-BA3.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖25?30g/L+卡拉膠 8.0 ?10.0g/L+ACl.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+CM10%，pH 為 5.5 ?6.5，光照培養25?35d得到叢生芽，光照培養條件為:光照10?12 h/d,光照強度1500?2000Lx，溫度 25±2°C ；
(3)增殖培養:將步驟(2)芽誘導培養得到的叢生芽切取單芽，接種至增殖培養基進行增殖培養，增殖培養基成分為MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.6mg/L+蔗糖25?30g/L+卡拉膠8.0 ?10.0 g/L+ACl.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+CM10%，ρΗ5.5 ?6.5，光照培養30?40d后切取生長健壯的單芽，備用，光照培養條件為:光照12?16 h/d，光照強度2000 ?2500Lx，溫度 25±2°C ；
(4)壯苗培養:將步驟(3)增殖培養中獲得的單芽接種至壯苗培養基進行壯苗培養，壯苗培養基成分為 MS+GA3L 0mg/L+NAA0.3mg/L+ 蔗糖 25 ?30g/L + 卡拉膠 8.0 ?10.0g/L +ACl.0?1.5g/L+50%多菌靈I?1.5g/L+椰汁15%，ρΗ5.5?6.5，光照培養15?20d后得到無根苗，光照培養條件為:光照12?16 h/d，光照強度2000?2500Lx，溫度25±2°C ；
(5)生根培養:將步驟(4)壯苗培養中獲得的無根苗接種至生根培養基進行生根培養，生根培養基成分為:MS+IBA1.0 mg/L+蔗糖25?30g/L +卡拉膠8.0?10.0 g/L +50%多菌靈I?1.5g/L+香蕉泥10%，pH5.5?6.5，光照培養25?35d得到生根的試管苗，光照培養條件為:光照10?12 h/d，光照強度1500?2000Lx，溫度25±2°C，統計生根率為86.1% ；
(6)煉苗移栽:將步驟(5)生根培養得到的試管苗，挑選苗高6?8cm的壯苗帶瓶移至溫度25±2°C、空氣相對濕度75?80%、光強2000?2500Lx的環境下，逐漸打開瓶蓋，煉苗2?3天，然后取出組培苗，洗凈培養基，栽至溫度16?26°C，空氣相對濕度80%?85%，光強2000?2500Lx環境下的苗床中，苗床基質由泥炭土、珍珠巖、松樹皮按體積比3:1:1混合而成，試管苗移栽成活率高為97.2%。
[0010]實施例2
(O外植體采集及消毒:春季剪取長2?3cm帶莖尖的蜈蚣蘭莖段，剝去葉片，用清水沖洗I?2h，在超凈工作臺上用75%乙醇溶液消毒40S，用0.1%升汞溶液消毒8min，用無菌水沖洗5?6次；
(2)芽誘導培養:將經步驟(I)消毒后的莖段切下莖尖，接種至芽誘導培養基，進行叢生芽誘導培養，芽誘導培養基成分為:MS+6-BA5.0mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖25?30g/L+卡拉膠 8.0 ?10.0g/L+ACl.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+CM10%，pH 為 5.5 ?6.5，光照培養25?35d得到叢生芽，光照培養條件為:光照10?12 h/d,光照強度1500?2000Lx，溫度 25±2°C ；
(3)增殖培養:將步驟(2)芽誘導培養得到的叢生芽切取單芽，接種至增殖培養基進行增殖培養，增殖培養基成分為MS+6-BA6.0mg/L+NAAl.0mg/L+蔗糖25?30g/L+卡拉膠8.0 ?10.0 g/L+ACl.0 ?1.5g/L+50% 多菌靈 I ?1.5g/L+CM10%，ρΗ5.5 ?6.5，光照培養30?40d后切取生長