一種草莓果實愈傷組織的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物生物技術領域，具體涉及一種愈傷組織的培養方法。
【背景技術】
[0002] 目前很多國家都開展了草莓基因組的研究，草莓基因組研究的方向主要涉及植株 抗性、果實品質果實生產特性等幾個大的方面，其中，草莓重要經濟性狀尤其是與果實品質 形成相關的分子機理研究也成為是草莓基因組研究的熱點。在草莓的分子機理研究方面， 愈傷組織成為常用的試驗材料，也是基因工程研究中進行基因轉化所必需的試驗材料。愈 傷組織是指外植體在離體培養條件下，形成的一團無極性、能旺盛分裂的薄壁細胞團，在培 養過程中，經過誘導分化可以發育成完整的再生植株。愈傷組織是植物的外植體經過脫分 化形成的，多種外植體都可以經過組織培養誘導形成愈傷組織，而植物愈傷組織因為具有 以下特點而被廣泛應用于植物分子機理和基因工程研究中。愈傷組織的特點：①無性繁殖， 大量擴繁；②為細胞懸浮培養和次生代謝產物生產與利用、原生質體培養和細胞融合提供 材料；③為植物體細胞無性系變異、細胞突變體篩選創造適宜的體系和基礎；④為外源基 因的遺傳轉化提供便于保存和利用的操對象；⑤為離體研究植物組織和細胞分裂、分化、代 謝和狀態的轉變創造適宜的材料和體系。
[0003] 目前對于愈傷組織的研究多集中研究葉片的愈傷組織，然而，隨著草莓分子生物 學研究的不斷深入，僅僅研究單一器官或者組織的愈傷組織培養，顯然不能滿足研究需要。 而對于草莓來說幾乎所有器官和組織都可以作為外植體，目前草莓的研究中，對果實品質 形成以及果實成熟發育的分子機理研究是一大熱點，因此，培養草莓果肉的愈傷組織是研 究草莓果實品質形成以及果實成熟發育分子機理的一條非常重要的途徑。
【發明內容】
[0004] 發明目的：本發明的目的在于為了克服現有技術的不足，提供一種草莓果實愈傷 組織的培養方法，建立高效快速的草莓果肉愈傷組織培養體系，果實愈傷組織誘導率達到 100%〇
[0005] 技術方案：本發明所述的一種草莓果實愈傷組織的培養方法，包括以下步驟：
[0006] (1)草莓果實的無菌化處理
[0007] 果實表面用流水沖洗干凈，在無菌條件下，用75%的乙醇消毒2分鐘后用無菌去 離子水沖洗3次，然后用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，再用無菌去離子水沖洗4~5次，然 后用無菌濾紙吸干果皮表面水分；消毒完成后用無菌的手術刀片小心削去果皮，從果實中 間切開，選取果心部分，用打孔器切直徑〇. 5厘米的圓片接種于愈傷誘導培養基上；
[0008] (2)草莓果實的圓片培養
[0009] 在沒有光照的黑暗培養箱中25°C培養5天后，果實原片周圍會有不規則形狀的愈 傷組織長出，這時在無菌條件下切下果肉邊緣的愈傷接種于愈傷組織增殖培養基中，培養 10~15天以后，愈傷體積變為原來體積的3~4倍大小。
[0010] 進一步，所述培養基為MS培養基，每升MS培養基中包括6-BAO. 4mg/L、NAA0. 2mg/ L、蔗糖20g/L、瓊脂粉6g/L。
[0011] 6-BA是6-芐氨基腺嘌呤，是一種細胞分裂素類的物質，具有高效、穩定、廉價和易 于使用等特點是組織培養者最喜愛的細胞分裂素，可以誘導愈傷組織發生。但是一般在誘 導愈傷組織發生時濃度不宜過高，本試驗中添加0. 4mg/L的6-BA就能夠很好的誘導'紅顏' 草莓果實愈傷組織的形成。NAA為萘乙酸，是組織培養中常用的植物生長調節劑，對于愈傷 組織的誘導和生長非常有效。蔗糖在植物組織培養基中起到能源物質和滲透調節劑的作 用，除供能之外，還能誘導愈傷組織的再分化，使用工業生產的分析純的蔗糖。一般的組織 培養中，蔗糖都是添加30g/L，在本試驗中，因為所選植物材料是果肉，果肉本身含有糖分， 因此培養時蔗糖濃度不宜過高，本試驗中所用蔗糖為20g/L。瓊脂粉在培養基中主要的作用 是固定支撐的作用，一般使用純度較高，沒有雜質的瓊脂粉。
[0012] 進一步，每升MS培養基包括：KN03硝酸鉀1500mg/L、（NH4)2S04硫酸銨500mg/L、 C0(NH2)2尿素 200mg/L、MgS0 4 ? 7H20 七水合硫酸鎂 400mg/L、KH2P04磷酸二氫鉀 200mg/L、KI 碘化鉀 1.lmg/L、MnS04，4H20 四水合硫酸錳 20mg/L、ZnS04，7H20 七水合硫酸鋅 8mg/L、H3B03 硼酸5mg/L、Fe-EDDHA乙二胺鄰二羥基乙酸鐵10mg/L、CaCl2，2H20二水合氯化鈣100mg/L、 肌醇l〇〇mg/L、煙酸2mg/L、維生素Bilmg/L、維生素B6lmg/L、維生素C2mg/L。常規MS培養基 的特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養分的 數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養和生理需要，但是本發明中由于草莓果實愈傷組 織的特殊性，因此需要對愈傷組織的生長特點細化MS培養基的組成成分。以硫酸銨和尿素 代替了原來MS培養基中的硝酸銨，增加了維生素C，在愈傷組織培養中需要較多的氮元素， 硫酸銨和尿素的添加，提供足夠的氮元素。其次，以上組織培養的過程中容易產生酚類醌類 物質導致愈傷組織褐化，因此，添加維生素C，能夠抑制酚類醌類物質的產生，防止褐化。
[0013] 進一步，所述培養基的PH值為5. 8,過高或者過低都會造成植株生長不好，或者死 亡，因此一定要精準調節PH值到5. 8。
[0014] 進一步，選用生長時期為花后5~8天的草莓作為培養對象。
[0015] 有益效果：本發明提供了一種草莓果實愈傷組織的培養方法，果實愈傷組織誘導 率可達到100%，草莓的分子生物學以及基因工程研究提供了一條新的途徑，為草莓基因工 程研究和基因轉化提供一種新的試驗材料，同時也為草莓果實愈傷的培養提供了參考和借 鑒。
【具體實施方式】
[0016] 下面對本發明技術方案進行詳細說明，但是本發明的保護范圍不局限于所述實施 例。
[0017] 實施例：
[0018] 分別選用植物材料為'紅顏'草莓花后5~8天、15-18天、23-25、28-30天的果實， 果實愈傷組織的培養方法按照以下步驟操作。
[0019] 1、外植體處理
[0020] 首先果實表面用流水沖洗干凈，在無菌條件下，用75%的乙醇消毒2分鐘后用無 菌去離子水沖洗3次，然后用10 %的次氯酸鈉消毒8分鐘，再用無菌去離子水沖洗4~5 次，然后用無菌濾紙吸干果皮表面水分。消毒完成后用無菌的手術刀片小心削去果皮，將果 心的果肉切成0. 5毫米的薄片后用直徑0. 5厘米的打孔器將果肉打成圓片后接種于已經準 備好的愈傷組織誘導培養基中。
[0021] 2、外植體培養
[0022] 在沒有光照的黑暗培養箱中25°C培養5天后果實圓片周圍會有不規則形狀的愈 傷組織長出，這時在無菌條件下切下果肉邊緣的愈傷接種于愈傷組織增殖培養基中，培養 10~15天以后，愈傷體積變為原來體積的3~4倍大小，增殖后的愈傷組織一部分可以用 來做分子生物學以及基因工程相關試驗，剩余的一部分可以再次接種于增殖培養基中繼續 增殖培養，供后續試驗所用。
[0023] 3、果肉愈傷組織質量評價指標
[0024] 果肉愈傷組織的質量好壞，有以下幾個評價指標：
[0025] (1)愈傷