一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物愈傷組織培養方法，特別是一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法。
【背景技術】
[0002]黃苗(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge)為豆科(Leguminosae sp.)黃苗屬(Astragalus Linn.)植物，黃苗含阜式、鹿糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及砸、鋅、銅等多種微量元素。黃芪具有較高的藥用價值，生用黃芪，有益氣固表、利水消腫、脫毒、生肌的功效，適用于自汗、盜汗、血痹、浮腫、癰疽不潰或潰久不斂等癥。蜜炙黃芪有補氣、養血、益中功效，適用于內傷勞倦、脾虛泄瀉、氣虛、血虛、氣衰等癥。現代藥理研究表明，黃芪具有增強機體免疫功能，強心降壓、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒、鎮靜及鎮痛等作用。目前，雖然黃芪作為臨床與食藥同源植物得到大量應用，但其植物資源基本來源于野生采挖，難以形成規模化生產，同時，大量采挖將會對采集地生態環境及野生黃芪資源造成極大的損害。利用組織培養技術生產藥用植物具有生長速度快、繁殖率高、擴繁周期短、室內繁殖條件可控、可不受季節限制周年培養等特點。目前文獻中還未見有關于利用愈傷組織培養技術大規模生產黃芪愈傷組織用于有效成分提取的研究報道。
[0003]黃芪為野生植物，由于它的成分獨特、資源較少、分布范圍狹窄，因此對它的繁殖研究具有重要的意義。目前已有移栽、扦插、愈傷誘導等研究，但文獻較少，專利更少。由于黃芪為多年生植物，導致移栽、扦插法無法實現快速大量繁殖。對它的組織培養的研究，包英華等已成功地從黃芪葉片誘導出愈傷組織，葉片愈傷組織中黃芪甲甙含量最高，分別為野生根的3倍、栽培根的3?5倍；張宗申等報道了光照比黑暗更有利于黃芪皂苷合成。但這些研究并沒有實現應用。目前仍然沒有實現黃芪快速、大量繁殖愈傷組織的技術。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法，該方法能夠在較短時間內獲得無褐化大量的黃芪葉片愈傷組織，通過生物技術手段解決黃芪植物資源缺乏的問題，為工業化提取黃芪有效成分提供充足原料。
[0005]本發明解決其技術問題采用如下技術方案:
一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方，其特征在于包括如下組分:植物組織培養基MS、細胞分裂素6-芐氨基嘌呤6-BA、生長素萘乙酸NAA、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、瓊脂、海藻酸鈉，在植物組織培養基MS中添加6-BA 0.6?1.5mg/L、NAA 0.2?1.6mg/L、鹿糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?10.0g/L、麥芽糖3.0?8.(^凡、瓊脂3.5?6.0g/L和海藻酸鈉0.2?0.5g/L ;使用質量比0.5?4.0%Na0H溶液調整培養基溶液pH值為5.6?5.8。
[0006]配方分為植物愈傷組織誘導培養基配方和繼代增殖培養基配方； 植物愈傷組織誘導培養基配方為:
植物組織培養基MS中添加6-BA 0.8?1.5mg/L、NAA 0.2?0.8mg/L、蔗糖15.0?20.(^/1、葡萄糖2.0?10.(^/1、瓊脂3.5?6.0g/L和海藻酸鈉0.2?0.5g/L，用質量比0.5?4.0%Na0H調整培養基溶液pH值為5.6?5.8 ;
繼代增殖培養基配方為:
植物組織培養基MS中添加6-BA 0.6?1.2mg/L、NAA 0.4?1.6mg/L、蔗糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?5.0g/L、麥芽糖3.0?8.0g/L、瓊脂3.2?5.0g/L和海藻酸鈉0.3?0.5g/L，用質量濃度0.5?4.0%Na0H調整培養基溶液pH值為5.6?5.8。
[0007]—種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法，其特征在于包括如下步驟:
A、外植體的選擇與滅菌:
以黃芪葉片為外植體，采集健康無病害的黃芪葉片，用無菌水清洗黃芪葉片3?5遍，在體積濃度70 %?75 %的乙醇溶液中浸泡30?50秒，隨后放入質量濃度0.10 %?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5.0?12.0分鐘，隨后用無菌水清洗3?5遍；
B、培養基滅菌:
愈傷組織誘導培養基、繼代增殖培養基分別分裝在10ml三角形培養瓶中，每瓶20.0?25.0ml，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.10?0.15MPa下滅菌20.0分鐘，冷卻備用;
C、愈傷組織誘導:
取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度2.0?5.0mm的小段，接種到滅菌后的植物愈傷組織誘導培養基上，培養溫度為22.0?28.0°C，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x，培養15?20天；
D、愈傷組織繼代增殖:
無菌條件下，從步驟C中選取淡黃綠色或綠色無褐變、質地疏松的愈傷組織，將其夾取2.0?5.0mm的組織后，轉接入滅菌后的愈傷組織繼代增殖培養基中，培養溫度為22.0?28.0°C，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x。培養15?20天。
[0008]步驟A中外植體為健康無病害的黃芪葉片，外植體的清洗過程為無菌水清洗3遍，在體積濃度70%的乙醇溶液中浸泡50秒，隨后放入質量濃度0.10%?0.15%的HgCl2S液中浸泡5?12分鐘，隨后用無菌水清洗5遍。
[0009]本發明的有益效果為:
1、此配方加入葡萄糖、麥芽糖代替部分蔗糖，更好的滿足黃芪葉片愈傷組織快速生長的需要。海藻酸鈉替代部分瓊脂，在減少瓊脂用量，降低培養基成本的同時增加固體培養基的支撐強度，更有利于培養基表面固定黃芪植物愈傷組織，促進新生黃綠色疏松愈傷組織快速繼代增殖。
[0010]2、乙醇、HgCl2處理可以完全殺滅黃芪葉片表面附著的微生物，在后續無菌培養中，解決殘留微生物污染培養基及愈傷組織問題。取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度2.0?5.0mm的小段，增加培養基表面放置葉片數量，提高誘導率，降低成本，接種到滅菌后的I號愈傷組織誘導培養基上，培養溫度為22.0?28.(TC，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x，培養15?20天。上述方法增加培養基表面放置葉片數量，提高誘導率，降低成本。連續光照增加愈傷組織的光合作用，促進組織增生。
[0011]綜上所述采用本發明培養黃芪愈傷組織，增殖速度快、產量大、生產周期短、耗能少，室內愈傷組織生長條件可控，且能夠實現大規模生產，有效的解決了黃芪工業化提取有效成分對原料的需求與野生資源保護之間的矛盾。
【具體實施方式】
[0012]一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方，包括如下組分:植物組織培養基MS、細胞分裂素6-芐氨基嘌呤6-BA、生長素萘乙酸NAA、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、瓊脂、海藻酸鈉，在植物組織培養基MS中添加6-BA 0.6?1.5mg/L、NAA 0.2?1.6mg/L、蔗糖15.0 ?20.0g/L、葡萄糖 2.0 ?10.0g/L、麥芽糖 3.0 ?8.0g/L、瓊脂 3.5 ?6.0g/L 和海藻酸鈉0.2?0.5g/L ;使用質量比0.5?4.0%Na0H溶液調整培養基溶液pH值為5.6
?5.8ο
[0013]其配方分為植物愈傷組織誘導培養基配方和繼代增殖培養基配方；
植物愈傷組織誘導培養基配方為:
植物組織培養基MS中添加6-ΒΑ 0.8?1.5mg/L、NAA 0.2?0.8mg/L、蔗糖15.0?20.(^/1、葡萄糖2.0?10.(^/1、瓊脂3.5?6.0g/L和海藻酸鈉0.2?0.5g/L，用質量比0.5?4.0%Na0H調整培養基溶液pH值為5.6?5.8。
[0014]上述配方加入葡萄糖代替部分蔗糖，更好的滿足誘導黃芪葉片產生愈傷組織的需要，提高誘導效果。海藻酸鈉替代部分瓊脂，在減少瓊脂用量，降低培養基成本的同時增加固體培養基的支撐強度，更有利于培養基表面固定黃芪葉片，促進葉片邊緣產生的新生綠色疏松愈傷組織快速生長。
[0015]繼代增殖培養基配方為:
植物組織培養基MS中添加6-BA 0.6?1.2mg/L、NAA 0.4?1.6mg/L、蔗糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?5.0g/L、麥芽糖3.0?8.0g/L、瓊脂3.2?5.0g/L和海藻酸鈉0.3?0.5g/L，用質量濃度0.5?4.0%Na0H調整培養基溶液pH值為5.6?5.8。
[0016]上述配方加入葡萄糖、麥芽糖代替部分蔗糖，更好的滿足黃芪葉片愈傷組織快速生長的需要。海藻酸鈉替代部分瓊脂，在減少瓊脂用量，降低培養基成本的同時增加固體培養基的支撐強度，更有利于培養基表面固定黃芪植物愈傷組織，促進新生黃綠色疏松愈傷組織快速繼代增殖。
[0017]—種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法，其特征在于包括如下步驟:
A、外植體的選擇與滅菌:
以黃芪葉片為外植體，采集健康無病害的黃芪葉片，用無菌水清洗黃芪葉片3?5遍，在體積濃度70 %?75 %的乙醇溶液中浸泡30?50秒，隨后放入質量濃度0.10 %?
0.15%的HgCl2溶液中浸泡5.0?12.0分鐘，隨后用無菌水清洗3?5遍；
B、培養基滅菌:
愈傷組織誘導培養基、繼代增殖培養基分別分裝在10ml三角形培養瓶中，每瓶20.0?25.0ml，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.10?0.15MPa下滅菌20.0分鐘，冷卻備用; C、愈傷組織誘導:
取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度2.0?5.0mm的小段，接種到滅菌后的植物愈傷組織誘導培養基上，培養溫度為22.0?28.0°C，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x，培養15?20天；
上述方