一種花櫚木組培消毒滅菌配方和組培方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于組織培養技術領域，具體涉及一種花櫚木組培消毒滅菌配方，還涉及 一種花櫚木組培方法。
【背景技術】
[0002] 花櫚木（Ae/z/yiPrain)是豆科紅豆屬常綠喬木，又名花梨木、臭桐柴，屬 國家二級重點保護植物，高5-13米，奇數羽狀復葉，長圓形或長圓倒披針形，四季常綠，無 明顯落葉現象；小枝及葉背密生灰黃色短柔毛；花期6-7月，黃白色，總狀花絮；莢果扁平， 成熟時呈黑褐色，種子紅色。花櫚木木材致密、紋理美麗、有光澤、耐腐蝕、易切削、切面光 滑，是珍貴用材樹種，又因其樹皮青綠光滑，樹姿優美成為優質園林綠化樹種，適合用作行 道樹及庭院栽培；其根、枝、葉還是名貴藥材，祛風散結、解毒祛瘀。
[0003]目前花櫚木以種子繁殖為主，但由于花櫚木種子種皮包被有蠟質層，阻礙種子吸 水發芽，因而自然條件下種子成熟散落后很難自然萌發，人工播種時采用85°c熱水對種皮 進行人工處理或進行破皮處理，可以顯著提高其發芽率。由于花櫚木野生植株稀少，結實困 難且結實率低，種子繁殖系數低。組織培養具有繁殖速度快、繁殖系數大、后代性狀整齊的 優點。因而建立花櫚木組織培養快繁體系，擴大繁殖系數，對花櫚木野生資源的保護和人工 培育具有重要意義。
[0004] 在組織培養過程中，外植體的消毒是極其重要的步驟，選擇合適的外植體及適當 的外植體消毒方法是組織培養成功的前提。現有的花櫚木組培方法是以花櫚木無菌萌發幼 苗為外植體進行，通過花櫚木種子消毒后在無菌環境中萌發得到的無菌籽苗作為外植體， 經過增殖、生根等步驟構建組培體系。但由于花櫚木種子資源的限制，外植體的獲得仍具有 一定的局限性。若花櫚木組培初代培養材料取自自然萌發生長的植株，由于其帶菌系數很 高，組培過程中外植體污染嚴重，成活率極低。只有篩選出更有效的消毒方法，才能進行進 一步的組織培養研究。
[0005] 在文獻"花櫚木的組織培養和快速繁殖(姚軍等，植物生理學通訊，200 7，01 : 123-124)"中采用種子無菌萌發獲得的帶葉莖段進行組織培養和快速繁殖研究，在文獻"花 櫚木胚軸愈傷組織的誘導及植株再生（高麗等，安徽農業科學，2009,33 :16271-16273)"中 則采用花櫚木種子無菌萌發獲得的胚軸進行組織培養及后續的耐冷性誘導，兩人采用的外 植體均來源于種子無菌萌發的材料，繁殖材料仍然有限。有關花櫚木自然萌發植株和成年 植株外植體獲得組培成功的案例尚未見報道，其原因是自然萌發植株和成年植株外植體內 生菌多，無菌培養體系建立困難。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是：提供一種花櫚木組培消毒滅菌配方和組培方法，旨 在解決花櫚木外植體組培中污染嚴重、成活率極低和難于誘導問題，以克服現有技術問題 的不足。
[0007] 本發明的技術方案：一種花櫚木組培消毒滅菌配方，包括70%酒精、0. 1%升汞、70% 酒精和向誘導培養基中添加〇.5ml/L植物組織培養抗菌劑（PPM)。
[0008]-種花櫚木組培消毒滅菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混 合液以及0. 1%的升汞。
[0009] 一種花櫚木組培消毒滅菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混 合液以及0. 1%升汞。
[0010] 一種花櫚木組培方法，該方法包括以下步驟： (1) 外植體的采集：采用苗齡10天的花櫚木籽苗莖段外植體； (2) 清洗：采用洗滌劑浸泡15分鐘，用流水沖洗30分鐘； (3) 消毒：將步驟（2)中洗凈的外植體拿入無菌工作臺內，采用權利要求1所述的一種 花櫚木組培消毒滅菌配方，依次采用70%酒精、0. 1%升汞和70%酒精浸泡，其浸泡時間分別 為0. 5分鐘、8分鐘和0. 5分鐘，每次消毒處理后均用無菌水沖洗4-5次； (4) 接種：將步驟（3)中清洗后的外植體接種在誘導培養基上，所述誘導培養基包括MS 培養基及附加成分，并向誘導培養基中添加〇. 5ml/L植物組織培養抗菌劑（PPM); (5) 培養：將步驟（4)中放置在誘導培養基中的外植體放入到培養箱中進行培養，采用 培養條件為：溫度23-27°C，光強2500-30001x，白天光照12小時。
[0011] 一種花櫚木組培方法，該方法包括以下步驟： (1) 外植體的采集：采用當年生花櫚木播種幼苗的帶頂芽莖段、帶側芽莖段或葉片外植 體，采集時間為4月份； (2) 清洗：采用洗滌劑浸泡30分鐘，用流水沖洗1小時； (3) 消毒：將步驟（2)中洗凈的外植體拿入無菌工作臺內，采用權利要求1所述的一種 花櫚木組培消毒滅菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%的升汞浸泡，針對葉片其浸泡時間分別為〇. 5分鐘、30分鐘和6分鐘，針對莖段其浸泡 時間分別為〇. 5分鐘、30分鐘和8分鐘，每次消毒處理后均用無菌水沖洗外植體4-5次； (4) 接種：將步驟（3)中清洗后的外植體接種在誘導培養基上，所述誘導培養基包括MS 培養基及附加成分； (5) 培養：將步驟（4)中放置在誘導培養基中的外植體放入到培養箱中進行培養，采用 培養條件為：溫度23-27°C，光強2500-30001x，白天光照12小時。
[0012] -種花櫚木組培方法，該方法包括以下步驟： (1) 外植體的采集：采用多年生花櫚木成年植株上的當年生葉片，采集時間為4月份； (2) 清洗：采用洗滌劑浸泡1小時，用流水沖洗2小時； (3) 消毒：將步驟（2)中洗凈的外植體拿入無菌工作臺內，采用權利要求1所述的一種 花櫚木組培消毒滅菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%升汞的浸泡，其浸泡時間分別為〇. 5分鐘、30分鐘和12分鐘，每次消毒處理后均用無 菌水沖洗外植體4-5次； (4) 接種：將步驟（3)中清洗后的外植體接種在誘導培養基上，所述誘導培養基包括MS 培養基及附加成分； (5) 培養：將步驟（4)中放置在誘導培養基中的外植體放入到培養箱中進行培養，采用 培養條件為：溫度23-27°C，光強2500-30001X，白天光照12小時。
[0013] 優選的，上述MS培養基成分如下： 硝酸鉀KN03 1 900mg/L 硝酸銨NH4N03 1 6 50mg/L 七水硫酸鎂MgS04. 7H20 370mg/L 磷酸二氫鉀KH2P04 1 70mg/L 二水氯化鈣CaC12. 2H20 440mg/L 四水硫酸錳MnS04. 4H20 22. 3mg/L 七水硫酸鋅ZnS04. 7H20 8. 60mg/L 硼酸H3B03 6 . 20mg/L 碘化鉀KI 0. 83mg/L 二水鉬酸鈉NaMo04. 2H20 0. 25mg/L 五水硫酸銅CuS04. 5H20 0. 025mg/L 六水氯化鈷CoC12. 6H20 0. 025mg/L 乙二胺四乙酸二鈉Na2-EDTA 37. 30mg/L 四水硫酸亞鐵FeS04. 4H20 27. 80mg/L 甘氨酸 2.OOmg/L 鹽酸硫胺素 0?lOmg/L 鹽酸吡哆醇 0? 50mg/L 煙酸 0? 50mg/L 肌醇 lOOmg/L; 上述附加成分為6-BA(6-節胺基噪呤，6-Benzylaminopurine)2.0mg/L，NAA(萘乙 酸，I-Naphthylacetic) 1. 0mg/L，瓊脂 8g/L，鹿糖 30g/L。
[0014] 本發明的有益效果：與現有技術相比，本發明有如下效果： (1)本發明采用70%酒精、0. 1%升汞、70%酒精和向增值培養基中添加0. 5ml/L植物組 織培養抗菌劑（PPM)對籽苗進行消毒，能夠大大降低污染率，將污染率控制在6. 67%，從而 大大提高籽苗的組培成活率，達到93. 33%，誘導率達到100%，組培效果顯著。
[0015] (2)本發明采用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡 30min+0. 1%升汞浸泡8min對幼苗的莖段進行消毒和和采用70%酒精浸泡30s+(50mg/L利 福平+50mg/L氯霉素)混合液浸泡30min+0. 1%升汞浸泡6min對幼苗的葉片進行消毒，都能 夠大大降低污染率，前者和后者將污染率控制在〇,大大提高幼苗外植體的組培成活率，前 者存活率達到33. 3%，后者存活率達到100%，前者誘導率到達60%，后者誘導率到達64. 29%， 組培效果顯著。
[0016] (3)本發明采用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡 30min+0. 1%升汞浸泡12min對花櫚木成年植株當年生葉片進行消毒，能夠大大降低污染率 將污染率控制在66. 67%，從而大大提高成年植株外植體的組培成活率，達到33. 33%，葉片 誘導率達到80%，莖段誘導率達到20%，組培效果較顯著。
[0017] (4)本發明采用花櫚木外植體的籽苗、幼苗及成年植株葉片進行組培，大大擴展了 組培繁殖材料的來源，有效解決了現有技術中只能采用花櫚木種子萌發籽苗進行組培的局 限性，并且也大大提高了組培的存活率和誘導率。由于籽苗外植體及當年生幼苗外植體較 為幼嫩，時間過長會導致外植體死亡，過短會導致消毒效果差，因此，采用本發明中的消毒 浸泡時間能夠大大提高消毒效果。
[0018] (5)本發明采用的消毒配方簡單，但能夠起到很好地消毒作用，在花櫚木的組織培 養中根據具體的情況設置浸泡時間和添加植物組織培養抗菌劑，起到了非常好的消毒效果