法增加培養基表面放置葉片數量，提高誘導率，降低成本。連續光照增加愈傷組織的光合作用，促進組織增生。
[0018]D、愈傷組織繼代增殖:
無菌條件下，從步驟C中選取淡黃綠色或綠色無褐變、質地疏松的愈傷組織，將其夾取
2.0?5.0mm的組織后，轉接入滅菌后的愈傷組織繼代增殖培養基中，培養溫度為22.0?28.0°C，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x。培養15?20天。
[0019]所述步驟A中外植體為健康無病害的黃芪葉片，外植體的清洗過程為無菌水清洗3遍，在體積濃度70%的乙醇溶液中浸泡50秒，隨后放入質量濃度0.10%?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5?12分鐘，隨后用無菌水清洗5遍。
[0020]實施例1:
A、外植體的選擇與滅菌:以黃芪葉片為外植體。采集健康無病害的黃芪葉片，無菌水清洗5遍，在體積濃度75%乙醇中浸泡30秒，隨后放入質量濃度0.10%的HgCl2溶液中浸泡12.0分鐘，隨后用無菌水清洗3遍。
[0021]B、培養基滅菌:愈傷組織誘導培養基、繼代增殖培養基分別分裝在10ml三角形培養瓶中，每瓶20.0ml，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.1OMPa下滅菌20.0分鐘，冷卻備用O
[0022]C、愈傷組織誘導:取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度2.0mm的小段，接種到滅菌后的愈傷組織誘導培養基上。愈傷組織誘導培養基配方為:MS+ 6-BA 1.5mg/L+NAA 0.8 mg/L+ 鹿糖 20.0g/L+ 葡萄糖 10.0 g/L+ 瓊脂 6g/L + 海藻酸鈉 0.5g/L，pH 值為5.8。培養溫度為28.0°C，每天連續光照24.0小時，光照強度30001x。培養20天后，愈傷組織誘導率為96.1%。
[0023]D、愈傷組織繼代增殖:無菌條件下，選取淡黃綠色或綠色無褐變、質地疏松的愈傷組織，將其夾取2.0mm的組織后，轉接入滅菌后的愈傷組織繼代增殖培養基中。愈傷組織繼代增殖培養基的配方為:MS+ 6-BA 1.2mg/L+NAA 1.6 mg/L+鹿糖20.0g/L+葡萄糖5.0 g/L+麥芽糖8.0g/L +瓊脂5.0g/L +海藻酸鈉0.5g/L，pH值為5.8。培養溫度為28.(TC，每天連續光照24.0小時，光照強度30001x。培養20天后，愈傷組織增殖4.3倍。
[0024]實施例2:
A、外植體的選擇與滅菌:以黃芪葉片為外植體。采集健康無病害的黃芪葉片，無菌水清洗3遍，在體積濃度72%乙醇中浸泡40秒，隨后放入質量濃度0.12%的HgCl2溶液中浸泡8.0分鐘，隨后用無菌水清洗4遍。
[0025]B、培養基滅菌:愈傷組織誘導培養基、繼代增殖培養基分別分裝在10ml三角形培養瓶中，每瓶22.0ml，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.1510^下滅菌20.0分鐘，冷卻備用。
[0026]C、愈傷組織誘導:取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度4.0mm的小段，接種到滅菌后的愈傷組織誘導培養基上。愈傷組織誘導培養基配方為:MS+ 6-BA 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L+ 鹿糖 15.0g/L+ 葡萄糖 2.0 g/L+ 瓊脂 3.5g/L + 海藻酸鈉 0.2g/L，pH 值為5.6。培養溫度為22.0°C，每天連續光照12.0小時，光照強度ΙΟΟΟΙχ。培養15天后，愈傷組織誘導率為86.4%。
[0027]D、愈傷組織繼代增殖:無菌條件下，選取淡黃綠色或綠色無褐變、質地疏松的愈傷組織，將其夾取3.0_的組織后，轉接入滅菌后的愈傷組織繼代增殖培養基中。愈傷組織繼代增殖培養基的配方為:MS+ 6-BA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L+蔗糖15.0g/L+葡萄糖2.0g/L+麥芽糖3.0g/L +瓊脂3.2g/L +海藻酸鈉0.3g/L，pH值為5.6。培養溫度為22.0°C，每天連續光照12.0小時，光照強度1000 lx。培養15天后，愈傷組織增殖2.8倍。
[0028]實施例3:
A、外植體的選擇與滅菌:以黃芪葉片為外植體。采集健康無病害的黃芪葉片，無菌水清洗3遍，在體積濃度70%乙醇中浸泡50秒，隨后放入質量濃度0.15%的HgCl2S液中浸泡5.0分鐘，隨后用無菌水清洗5遍。
[0029]B、培養基滅菌:愈傷組織誘導培養基、繼代增殖培養基分別分裝在10ml三角形培養瓶中，每瓶25.0ml，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.12MPa下滅菌20.0分鐘，冷卻備用O
[0030]C、愈傷組織誘導:取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度5.0mm的小段，接種到滅菌后的愈傷組織誘導培養基上。愈傷組織誘導培養基配方為:MS+ 6-BA 1.0mg/L+NAA 0.6mg/L+ 鹿糖 18.0g/L+ 葡萄糖 8.0g/L+ 瓊脂 4.0g/L + 海藻酸鈉 0.3 g/L, pH 值為5.7。培養溫度為25.0°C，每天連續光照20.0小時，光照強度2000 lx。培養18天后，愈傷組織誘導率為91.6%。
[0031]D、愈傷組織繼代增殖:無菌條件下，選取淡黃綠色或綠色無褐變、質地疏松的愈傷組織，將其夾取5.0mm的組織后，轉接入滅菌后的愈傷組織繼代增殖培養基中。愈傷組織繼代增殖培養基的配方為:MS+ 6-BA 0.8mg/L+NAA 1.0mg/L+鹿糖18.0g/L+葡萄糖3.0g/L+麥芽糖5.0 g/L +瓊脂4.0g/L +海藻酸鈉0.4 g/L, pH值為5.6。培養溫度為26.(TC，每天連續光照20.0小時，光照強度20001x。培養18天后，愈傷組織增殖倍3.2。
【主權項】
1.一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方，其特征在于包括如下組分:植物組織培養基MS、細胞分裂素6-芐氨基嘌呤6-BA、生長素萘乙酸NAA、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、瓊脂、海藻酸鈉，在植物組織培養基MS中添加6-BA 0.6?1.5mg/L、NAA 0.2?1.6mg/L、鹿糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?10.0g/L、麥芽糖3.0?8.(^凡、瓊脂3.5?6.0g/L和海藻酸鈉0.2?0.5g/L ;使用質量比0.5?4.0%Na0H溶液調整培養基溶液pH值為5.6?5.8。2.如權利要求1所述的一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方，其特征在于配方分為植物愈傷組織誘導培養基配方和繼代增殖培養基配方； 植物愈傷組織誘導培養基配方為: 植物組織培養基MS中添加6-BA 0.8?1.5mg/L、NAA 0.2?0.8mg/L、蔗糖15.0?20.(^/1、葡萄糖2.0?10.(^/1、瓊脂3.5?6.0g/L和海藻酸鈉0.2?0.5g/L，用質量比0.5?4.0%Na0H調整培養基溶液pH值為5.6?5.8 ; 繼代增殖培養基配方為: 植物組織培養基MS中添加6-BA 0.6?1.2mg/L、NAA 0.4?1.6mg/L、蔗糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?5.0g/L、麥芽糖3.0?8.0g/L、瓊脂3.2?5.0g/L和海藻酸鈉0.3?0.5g/L，用質量濃度0.5?4.0%Na0H調整培養基溶液pH值為5.6?5.8。3.如權利要求1或2所述一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法，其特征在于包括如下步驟: A、外植體的選擇與滅菌: 以黃芪葉片為外植體，采集健康無病害的黃芪葉片，用無菌水清洗黃芪葉片3?5遍，在體積濃度70 %?75 %的乙醇溶液中浸泡30?50秒，隨后放入質量濃度0.10 %?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5.0?12.0分鐘，隨后用無菌水清洗3?5遍； B、培養基滅菌: 愈傷組織誘導培養基、繼代增殖培養基分別分裝在10ml三角形培養瓶中，每瓶20.0?25.0ml，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.10?0.15MPa下滅菌20.0分鐘，冷卻備用; C、愈傷組織誘導: 取滅菌后的黃芪葉片用無菌手術刀切成長度2.0?5.0mm的小段，接種到滅菌后的植物愈傷組織誘導培養基上，培養溫度為22.0?28.0°C，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x，培養15?20天； D、愈傷組織繼代增殖: 無菌條件下，從步驟C中選取淡黃綠色或綠色無褐變、質地疏松的愈傷組織，將其夾取2.0?5.0mm的組織后，轉接入滅菌后的愈傷組織繼代增殖培養基中，培養溫度為22.0?28.0°C，每天連續光照12.0?24.0小時，光照強度1000?30001x ;培養15?20天。4.如權利要求3所述的一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法，其特征在于步驟A中外植體為健康無病害的黃芪葉片，外植體的清洗過程為無菌水清洗3遍，在體積濃度70%的乙醇溶液中浸泡50秒，隨后放入質量濃度0.10%?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5?12分鐘，隨后用無菌水清洗5遍。
【專利摘要】本發明涉及一種黃芪植物愈傷組織誘導及繼代增殖的培養基配方及其培養方法。包括外植體選擇與滅菌，培養基滅菌、愈傷組織誘導，愈傷組織繼代增殖四個步驟。黃芪植物愈傷組織培養方法采用黃芪葉片為外植體，在MS基本培養基中加入麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、瓊脂粉、海藻酸鈉、萘乙酸、6-芐基嘌呤等構成的培養基中進行組織培養，得到黃芪葉片愈傷組織。調培養基pH值，配制好的愈傷組織誘導培養基、愈傷組織繼代增殖培養基分別裝在三角形培養瓶中，瓶口蓋透氣塑料封口膜，在壓力為0.10~0.15MPa下滅菌后進行愈傷組織培養。本發明可實現對黃芪葉片愈傷組織的有效誘導和快速增殖，在較短時間內獲得大量黃芪葉片愈傷組織，具有生產周期短、增殖速度快的特點，適合工業化生產。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165626
【申請號】
【發明人】趙瑛, 羅俊杰, 王紅梅, 張運暉, 崔明九, 葉春雷, 歐巧明, 薛蓮
【申請人】甘肅省農業科學院生物技術研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月22日