一種虎斑兜蘭組培快繁方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組織培養研究領域，具體涉及一種虎斑兜蘭組培快繁方法。
【背景技術】
[0002]虎斑3?蘭(Paph1pedilum markianum Fowlie)是蘭科9?蘭亞屬地生或半附生植物，中國特產種，產于云南西部，多生長在海拔1500?2000m、石灰巖地區的疏林樹上、覆蓋苔蘚的巖石上或多石區，野生種質資源已十分稀少，葉片狹矩圓形，花大，淡黃綠色，花期6?8月，可用于植物園、盆栽、切花或布置花境，具有獨特的觀賞價值和育種潛力，但由于生境的破壞，人為毀滅性采挖、出售，虎斑兜成為世界上瀕危的物種之一，已被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》，急需采取措施加以保護。
[0003]兜蘭是組培最難的蘭科植物之一，有關虎斑兜蘭的研究報道極少，雜交種的組織培養相對較易，原生種的組織培養較難，虎斑兜蘭的莖極短，又靠近土壤生長，切取外植體十分困難，極易受菌類污染。虎斑兜蘭由于單個果實內具有較多種子，因而利用種子無菌萌發培養是常用繁殖手段，但易受種源限制，由于虎斑兜蘭種群數量逐漸較少，目前在野外幾乎很難尋覓到自然健康生長的種群，如果長期用少數個體產生的種子進行繁殖，經過若干代以后將面臨自然衰退的威脅，目前利用種子作為外植體，進行組織培養的方法尚未取得突破性進展。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于解決現有技術存在的問題，利用植物組培快繁的方法獲得大量優質虎斑兜蘭種苗，采用的技術方案如下:
(1)外植體滅菌:人工授粉140d后，采集未開裂的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌30?50s，再用10%次氯酸鈉滅菌10?15min，無菌水沖洗5?7次；
(2)種子萌發培養:在無菌條件下將滅菌后的蒴果切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，在溫度25±2°C，光照14 h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養7?8周，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為1/2RE+6-BA0.6mg/L+ACl.0g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L，PH 為 6.0 ?6.5 ;
(3)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，在溫度25±2°C，光照14h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養8?9周，得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 胰蛋白胨 3g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為6.0 ?6.5 ;
(4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，在溫度25±2°C，光照14h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養7?8周，得到具有I?2片葉的小苗，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+ 鮮棗汁 80ml/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂6g/L，PH 為 6.0 ?6.5 ;
(5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，在溫度25±2°C，光照14h/d，光照強度2000?2500Lx條件下培養7?8周，得到根長3?4cm的試管苗，所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+ 鮮棗汁 80ml/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為6.0 ?6.5 ;
(6)煉苗移栽:將試管苗帶瓶移至常溫、無直射光環境下，煉苗I周，取出試管苗，用清水洗凈培養基，用浸泡過的水苔包裹根部栽到營養杯中，環境要求通風良好，遮光65%?70%，空氣相對濕度70%?75%，溫度15?28°C，2周后試管苗即可成活。
[0005]本發明的有益效果體現在:本發明以虎斑兜蘭種子為外植體，建立了組培繁殖體系，取得了虎斑兜蘭組培快繁方法的突破性進展，采用本方法得到的組培苗遺傳性狀穩定，繁殖系數高，繁殖周期短，移栽成活率達92%以上，有利于虎斑兜蘭野生資源的保護與開發，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0006]圖1為本發明的種子萌發培養的示意圖。
[0007]圖2為本發明的增殖培養的示意圖。
[0008]圖3為本發明的分化培養的示意圖。
[0009]圖4為本發明的生根培養的示意圖。
[0010]圖5為本發明的試管苗移栽成活的示意圖。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
一種虎斑兜蘭組培快繁方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)外植體滅菌:人工授粉140d后，采集未開裂的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌40s，再用10%次氯酸鈉滅菌12min，無菌水沖洗6次；
(2)種子萌發培養:在無菌條件下將滅菌后的蒴果切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，在溫度25±2°C，光照14 h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養52d，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為1/2RE+6-BA0.6mg/L+ACl.0g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L，PH為6.0?6.5，如圖1所示；
(3)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，在溫度25±2°C，光照14h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養60d，得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 胰蛋白胨 3g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為6.0?6.5，如圖2所示;
(4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，在溫度25±2°C，光照14h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養52d，得到具有I?2片葉的小苗，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+ 鮮棗汁 80ml/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH為6.0?6.5，如圖3所示；
(5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，在溫度25±2°C，光照14h/d，光照強度2000?2500Lx條件下培養50d周，得到根長3?4cm的試管苗，所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+ 鮮棗汁 80ml/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為6.0?6.5，如圖4所示； (6)煉苗移栽:將試管苗帶瓶移至常溫、無直射光環境下，煉苗I周，取出試管苗，用清水洗凈培養基，用浸泡過的水苔包裹根部栽到營養杯中，環境要求通風良好，遮光65%?70%，空氣相對濕度70%?75%，溫度15?28°C，2周后試管苗即可成活，移栽成活率達93%以上，如圖5所示。
[0012]實施例2
一種虎斑兜蘭組培快繁方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)外植體滅菌:人工授粉140d后，采集未開裂的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌30s，再用10%次氯酸鈉滅菌lOmin，無菌水沖洗5次；
(2)種子萌發培養:在無菌條件下將滅菌后的蒴果切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，在溫度25 ±2°C，光照14 h/d，光照強度1600?2000Lx條件下培養7周，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為1/2RE+6-BA0.6mg/L+ACl.0g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L，PH為6.0?6.5，如圖1