一種基于配子體克隆系的海帶屬褐藻引種方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種基于配子體克隆系的海帶屬褐藻引種方法。
【背景技術】
[0002]海藻是重要的海洋資源，有著廣泛的用途，可以作為食品，例如海帶、紫菜是廣受人們喜愛的海洋食品；海藻也是海產養殖動物，如鮑魚、海參的餌料，還是提取碘、藻膠和甘露醇的重要化工原料。另外，海藻對近海生態環境的修復和保護也具有重要意義。海藻增養殖是海藻資源高效、可持續利用的重要途徑，經過幾十年的發展，海藻養殖業已發展成為我國海洋產業的重要組成部分，以褐藻類的海帶為例，每年的養殖面積約37625公頃，養殖產量約827965噸，產量、規模位居世界第一。大型經濟褐藻是我國海藻養殖的重要類型之一，但是我國原產的種類并不豐富，例如養殖海藻中養殖規模最大的海帶就不是我國的原產種。積極從世界各地收集具有重要經濟價值的海帶屬大型褐藻，對豐富我國養殖褐藻的種類、儲存海帶等種類的優良種質，從而推動我國海藻養殖產業可持續發展具有重要戰略意義。
[0003]當前具有養殖潛力和價值的經濟褐藻類，多為大型海藻，其體型較大，例如海帶屬的種類，其藻體長度可達數米，這就造成了它們難以長途運輸，從而使得這些種類很難實現跨國引種或移植。因此，當前大型經濟褐藻的引種技術亟需創新和突破。然而，目前僅有關于海帶引種的少量報道，即利用海帶配子體世代容易保存和運輸的特點，進行海帶的引種和移植。該方法可以克服長途運輸過程中的因藻體過大而不易運輸、孢子體容易腐爛的問題，但也存在著雌雄配子體未分離、附苗器體積大等問題。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題在于提供一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法。該方法，不僅可以解決大型經濟褐藻引種過程中的孢子體體積過大、容易腐爛、孢子易放散丟失或質量不高等問題，還可以解決以往海帶引種中的雌雄配子體未分離、附苗器體積大等問題。
[0005]為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現:
[0006]一種基于配子體克隆系的海帶屬褐藻引種方法，包括種藻選擇與預處理、孢子采集、配子體培養、雌雄配子體分離、配子體克隆系長途運輸、配子體克隆系擴繁和配體體克隆系長期保存；
[0007]I)種藻選擇與預處理選擇發育成熟的種藻，低溫取回并用無菌海水將種藻清洗干凈，進行陰干處理；
[0008]2)孢子采集將載有孢子囊的孢子體組織塊置于入滅菌海水中，使孢子放散，放散完畢后將將孢子體組織塊撈出，過濾掉粘液和雜物，得到孢子水，將孢子水加入置有滅菌載玻片的容器中，孢子水剛剛沒過載玻片，黑暗過夜培養，溫度8_12°C ;
[0009]3)配子體培養經黑暗過夜的載玻片，置于以下條件繼續進行培養:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水，溫度為8-12°C，光照度為20-30 μ molm 2S \光周期為光照時間:黑暗時間=12:12h，每隔2天更換培養液；
[0010]4)雌雄配子體分離在步驟3的條件下，配子體培養7天后，每天鏡檢配子體發育情況，待到能從形態上區分雌雄配子體時，分離雌、雄配子體，雌、雄配子體分別進行培養；培養條件同步驟3)中所述；
[0011]5)配子體克隆系長途運輸取少量步驟4)中培養的雌、雄配子體克隆，分別轉移到不同的培養管中，更換新鮮的培養液，將培養管置于保溫盒，保持溫度不高于18°C，進行長途運輸；
[0012]6)配子體克隆系擴繁將經過長途運輸的雌、雄配子體，分別轉移至不同培養容器中，置于以下條件繼續進行培養:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水，溫度為10-12°C，光照度為30-50 μ molm 2S \光周期為光照時間:黑暗時間=12:12h，每隔2天更換培養液；
[0013]7)配子體克隆系長期保存:經步驟6)的方法進行兩周培養后，將配子體克隆系分為兩份，二者互為備份，置于以下條件進行長久保存:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水，溫度為0-4°C，光照度為不高于5 μ molm 2S \光周期為光照時間:黑暗時間=12:12h，培養液更換頻率為6個月I次，雌雄配子體分別培養。
[0014]進一步，步驟I)所選擇藻種的標準為個體大、完整，顏色正常、具光澤，表面無其它附著生物，孢子囊飽滿的種藻。
[0015]進一步，步驟I)所述的低溫為0-10°C
[0016]進一步，所述步驟4)的雌雄配子體分離是在顯微鏡下使用移液器或毛細管分離。
[0017]在本發明技術方案的步驟I)中，還具有以下技術特征:種藻選擇時，應選取目標海藻生長茂盛的海區，在大潮退潮至最低線，在海藻群體中選擇種藻。
[0018]在本發明技術方案的步驟I)中，還具有以下技術特征:種藻孢子體陰干時，應置于陰涼通風處，溫度控制在20°C以下，直至孢子體表面水分蒸干、藻體稍干燥為止。
[0019]在本發明技術方案的步驟2)中，還具有以下技術特征:在孢子體放散時，檢查游孢子密度，待游孢子的密度為在100倍顯微鏡下一個視野有10?20個時，撈出孢子體組織塊。
[0020]本發明的技術方案的加氮磷營養鹽的滅菌海水，它的成分及其終濃度:KN03200 ymolL 1 和 KH 2P0420 ymolL 1O
[0021]本發明與現有技術相比的有益效果:
[0022]I)利用海帶屬海藻配子體世代體積小、易保存的特點，進行長途運輸，能避免孢子體體積過大、不易運輸、容易腐爛、孢子易放散丟失或質量不高等問題，從而提高了引種的成功率；2)在對配子體進行長途運輸前，將雌雄配子體分離，避免了運輸過程中雌雄配子體成熟、排精排卵而受精產生幼孢子體。3)配子體運輸時并非附著在苗簾或載玻片上，而是游離狀態，運輸時僅僅取極少量的配子體克隆系，占用體積小，無需更換培養液，簡單易行，成功率可高達100%。
【附圖說明】
[0023]圖1是顯微鏡下雌、雄配子體的外觀形態圖:1、雄配子體，2、雌配子體；
[0024]圖2是配子體克隆長途運輸的培養管圖:3、配子體克隆；
[0025]圖3是可長期保存的配子體克隆系圖:4、配子體克隆系。
【具體實施方式】
[0026]下面通過實施例來對本發明的技術方案作進一步詳細的說明，但本發明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。
[0027]實施例1
[0028]本實施例以極北海帶的引種為例，具體步驟包括:
[0029]1.種藻選擇與預處理。選擇目標海藻生長茂盛的海區，在大潮退潮至最低線，在海藻群體中選擇種藻，選擇種藻的標準如下:藻體個體大、完整，顏色正常、具光澤，表面無其它附著生物，孢子囊飽滿。用無菌解剖刀切下載有孢子囊的孢子體組織塊，置于冰盒，控溫在4°C左右，盡快帶回實驗室。
[0030]將帶回實驗室的孢子體組織塊，用滅菌海水清洗，用滅菌脫脂棉花輕輕擦拭藻體表面，清除附著物；將清洗干凈的孢子體置于陰涼通風處(溫度控制在20°C以下)，進行陰干處理，時間約為I小時，直至孢子體表面水分蒸干、藻體稍干燥為止。
[0031]2.孢子采集