一種氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥和納米材料技術領域，涉及一種氧化還原敏感型可降解納米微球載體的制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，提高抗癌藥物載體轉載效率的研究成為熱點，主要研究方向是集多功能于同一載體，實現多因子靶向、復合載藥和可控釋藥。載體的載藥元件設計、靶向制導方法、藥物釋放策略等方面的新思路不斷涌現，新型高效多功能納米載體的構建越來越受到研究者的青睞。
[0003]智能型藥物載體一般由通過含有環境敏感基團相連的載藥基質與藥物共同組成。選取可降解的材料，如聚氨基酸、殼聚糖等作為載藥基質，不但能提高載體對正常組織細胞的生物相容性，而且避免載體在生物體內的沉積，有效減少腫瘤治療過程的副作用。智能型藥物釋放行為控制就是選擇合適的鏈接基團，使之在特定的條件下快速降解，釋放出藥物，并且不會對藥物的結構和功能產生任何影響。
[0004]智能型藥物載體在一定程度上能夠克服臨床普遍存在的多藥耐藥問題，智能型藥物載體的研究對腫瘤治療具有重要意義。解決載體存在的可引發不良反應、易被網狀內皮組織吞噬、主動靶向性差等問題是目前研究的重點。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對目前腫瘤載體主動靶向性能不高，體內不可降解導致沉積引發不良發應，以及對載藥的控釋效率低等問題，提供一種有機-無機載藥基質相結合、對腫瘤細胞的PH值和還原性環境高度敏感的氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法。該微球載體具有靶向功能強、藥物控釋智能、結構穩定、無毒副作用等特點。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0007]—種氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法，采用微乳液技術合成磷酸鈣微粒，在微粒表面涂布一層可降解的有機大分子物質形成載藥核心。把還原性環境敏感型交聯元件組裝到載藥核心上，之后接枝改性的靶向因子，最終合成智能型靶向納米微球載體。具體制備步驟如下:
[0008]一、CaP微粒制備:
[0009](I)取濃度為0.1?0.5moL/L的CaCl2溶液加入到由環己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚組成的油相中，油相中環己烷與聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的體積比為70: 10?100，CaCl2S液與油相的體積比為1: 10?30。
[0010](2)另取濃度為10?30mmoL/L的Na2HPO3溶液和濃度為20?50mmoL/L 二羥基苯丙氨酸(DOPA)的三氯甲烷溶液滴入到另一份上述油相中，Na2HPO3溶液與油相的體積比為1: 10?30，DOPA的三氯甲烷溶液與油相體積比為1: 20?60，Na2HPOr^ DOPA的摩爾比為1: 0.5?5。
[0011](3)兩相混合攪拌2?8h，控制Na2HPO3與CaCl 2的摩爾比為I: 10?25。
[0012](4)加入乙醇，乙醇與混合相總體積比為1: 3?8，高速離心，棄上清液，沉淀用乙醇清洗，冷凍干燥得到CaP微粒。
[0013]二、載藥核心裝配:
[0014]取CaP微粒用去離子水或者三氯甲烷重懸，CaP微粒濃度為5?20mg/mL，將改性活化的大分子和抗癌藥物溶于DMS0，改性活化的大分子濃度為I?10mg/mL，抗癌藥物濃度為0.5?5mg/mL，將兩組溶液混合，控制CaP微粒與活化的大分子的摩爾比為1: 0.5?4，CaP微粒與抗癌藥物的摩爾比為1: 0.1?10，室溫環境下攪拌4?24h，組裝成載藥核心微粒，高速離心，冷凍干燥。
[0015]三、氧化還原敏感型控釋元件組裝:
[0016]取載藥核心微粒分散到濃度為I?15mg/mL的N，N- 二甲基甲酰胺(MSDS)溶液中，添加1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HC1)的水溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，加入含有二硫鍵的控釋元件，控制載藥核心微粒與含有二硫鍵的控釋元件的摩爾比為1:1?5，載藥核心微粒與EDC -HCl的質量比為1:1?5，載藥核心微粒與NHS的質量比為1:1?5，40?60°C條件下攪拌12?48h，將控釋元件組裝到載藥核心上。
[0017]四、靶向元件修飾:
[0018]取上述含有控釋元件的產物加入到濃度為0.1?lmmol/L EDTA的中性磷酸緩沖液中，含有控釋元件的產物與緩沖液的比例為1: 0.5?4 (m/v)，加入靶向分子，控制靶向分子濃度為I?20mmol/L，在室溫氮氣保護條件下反應12?48h，用去離子水透析，凍干，獲得智能型納米革G向載體。
[0019]本發明中，所述載藥核心的大分子為活化的殼聚糖(CS)、聚己內酯(PCL)或聚乙稀亞胺(PEI)的其中之一或任意兩者的共聚物。
[0020]本發明中，所述載藥核心運載的抗癌藥物為鹽酸阿霉素(DOX)和/或siRNA。
[0021]本發明中，所述氧化還原敏感型控釋元件為巰基乙胺修飾的寡肽片段(PAsp (MEA))、胱氨二鹽酸鹽或二硫代二丙酸的一種。
[0022]本發明中，所述靶向元件選用腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)、雙功能肽R13或葉酸的一種。
[0023]本發明中，所述他2即03與CaCl 2的摩爾比可進一步優化為1: 12?20，Na 2ΗΡ03與DOPA的摩爾比可進一步優化為1: 0.8?4，油相中環己烷與聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的體積比可進一步優化為70: 20?80。
[0024]本發明中，所述CaP微粒與活化的大分子的摩爾比可進一步優化為1: 0.8?
3.4。
[0025]本發明中，所述載藥核心微粒與含有二硫鍵的控釋元件的摩爾比可進一步優化為I: 1.2?4，載藥核心微粒與EDC.HCl的質量比可進一步優化為1: 1.2?4，載藥核心微粒與NHS的質量比可進一步優化為1: 1.2?4。
[0026]本發明中，所述革El向分子濃度可進一步優化為I?16mmol/L。
[0027]本發明具有如下優點:
[0028](I)對正常細胞無毒，釋放藥物伴隨降解。
[0029](2)靶向性強，藥物智能控釋。
[0030](3)本發明所述智能靶向載體能夠有效提高腫瘤治療效果，具有較高的應用前景。
【附圖說明】
[0031]圖1為負載鹽酸阿霉素(DOX)的GCP-SS-R掃描電鏡圖片。
【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發明的保護范圍中。
[0033]實施例1
[0034]本實施例按以下步驟制備負載鹽酸阿霉素(DOX)的GCP-SS-R:
[0035]a、取1mL 0.3moL/L的CaCl2溶液加入到200mL油相中。油相的組成:環己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚為80/30 (v/v)。另取1mL 15mmoL/L Na2HPO3S液和5mL濃度為30mmol/L的DOPA三氯甲烷溶液到另一份上述油相中。兩相混合攪拌2h。加入10mL乙醇，1000rpm離心30min，除去上層環己烷和表面活性劑，用乙醇清洗3次，冷凍干燥得到CaP微粒。
[0036]b、取10mg CaP微粒添加1ml去離子水，另取10mg改性活化的殼聚糖和1mg DOX溶于50mL DMSO, CaP乳濁液緩慢滴入到殼聚糖溶液中，25°C不斷攪拌，反應8h，1000rpm離心30min，棄上清，冷凍干燥，獲得負載DOX的GCP微粒。
[0037]c、取10mg GCP微粒轉移到50mL濃度為5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中緩慢滴加1mL (濃度10 %，m/v) EDC.HCl水溶液和1mL (濃度10 %，m/v) NHS,室溫反應，加入10mgPAsp(MEA)，不斷攪拌，40°C氮氣保護條件下反應20h，將控釋元件組裝到載藥核心上。
[0038]d、取50mg上述產物加入到含有50mL 0.lmmol/L EDTA的中性磷酸緩沖液中，加入20 μ g R13，在室溫氮氣保護條件下反應24h。用截留分子量為8000的透析袋透析48h，冷