凍干燥，獲得智能型納米靶向載體GCP-SS-R，其掃描電鏡圖如圖1所示。
[0039]檢測結果顯示，GCP-SS-R納米微球粒徑分布均勻，平均粒徑為108_176nm。DOX包封率為75.3%，在谷胱甘肽的濃度為2mM，pH為5.0的PBS中8小時的釋放量達到52.4%。
[0040]實施例2
[0041]本實施例按以下步驟制備負載siRNA的PCP-SS-T:
[0042]a、按照實施例1的a步驟制備CaP微粒。
[0043]b、取1mg CaP微粒添加5ml去離子水，另取1mg改性活化的PEI和100 μ g siRNA溶于1mL DMSO, CaP乳濁液緩慢滴入到PEI溶液中，25°C條件下不斷攪拌8h，1000rpm離心30min，棄上清，冷凍干燥，獲得負載siRNA的PCP微粒。
[0044]c、取1mg PCP微粒轉移到1mL濃度為5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中緩慢滴加2mL (濃度10 %，m/v) EDC.HCl水溶液和2mL (濃度10 %，m/v) NHS,室溫反應，加入1mgPAsp (MEA)，不斷攪拌，40°C氮氣保護條件下反應48h，將控釋元件組裝到載藥核心上。
[0045]d、取1mg上述產物加入到含有1mL濃度為0.lmmol/L EDTA的中性磷酸緩沖液中，加入10yg TRAIL，在30°C氮氣保護條件下反應48h。用截留分子量為8000的透析袋透析72h，低溫冷凍干燥，獲得智能型納米靶向載體PCP-SS-T。
[0046]PCP-SS-T納米微球粒徑分布均勻，平均粒徑為150-197nm。siRNA包封率為89.3%,在谷胱甘肽的濃度為2mM，pH為5.0的PBS中8小時的釋放量達到72.4%。
[0047]實施例3
[0048]本實施例按以下步驟制備負載DOX和siRNA的PCP-SS-T:
[0049]a、按照實施例1的a步驟制備CaP微粒。
[0050]b、取1mg CaP微粒添加5ml去離子水，另取1mg改性活化的PE1-CS共聚物和溶于1mL DMSO,加入100 μ g siRNA和Img D0X,將CaP乳濁液緩慢滴入到PE1-CS溶液中，25°C條件下不斷攪拌8h，1000rpm離心30min，棄上清，冷凍干燥，獲得負載siRNA和DOX的PCCP微粒。
[0051 ] c、取1mg PCCP微粒轉移到1mL濃度為5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中緩慢滴加2mL (濃度10 %，m/v) EDC.HCl水溶液和2mL (濃度10 %，m/v) NHS,室溫反應，加入1mg胱氨二鹽酸鹽，不斷攪拌，40°C氮氣保護條件下反應6h，將控釋元件組裝到載藥核心上。
[0052]d、取1mg上述產物加入到含有1mL濃度為0.lmmol/L EDTA的中性磷酸緩沖液中，添加10yg TRAIL，在30°C氮氣保護條件下反應48h。用截留分子量為8000的透析袋透析72h，低溫冷凍干燥，獲得智能型納米靶向載體PCCP-SS-T。
[0053]檢測結果顯示，PCCP-SS-T納米微球粒徑分布均勻，平均粒徑為214-299nm。siRNA包封率為84.9%，DOX包封率為85.2%。在谷胱甘肽的濃度為2mM，pH為5.0的PBS中8小時siRNA的釋放量達到63.1%, DOX達到71.4%。
【主權項】
1.一種氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述制備方法步驟如下: 一、CaP微粒制備: (1)取濃度為0.1?0.5moL/L的CaCl2溶液加入到由環己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚組成的油相中，油相中環己烷與聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的體積比為70: 10?100，CaCl2S液與油相的體積比為I: 10?30; (2)另取濃度為10?30mmoL/L的Na2HPO3溶液和濃度為20?50mmoL/LDOPA的三氯甲烷溶液滴入到另一份上述油相中，Na2HPO3S液與油相的體積比為1: 10?30，DOPA的三氯甲烷溶液與油相體積比為1: 20?60，Na2HPO^DOPA的摩爾比為1: 0.5?5 ; (3)兩相混合攪拌2?8h，控制Na2HPO3與CaCl2的摩爾比為I: 10?25 ; (4)加入乙醇，高速離心，棄上清液，沉淀用乙醇清洗，冷凍干燥得到CaP微粒； 二、載藥核心裝配: 取CaP微粒用去離子水或者三氯甲烷重懸，將改性活化的大分子和抗癌藥物溶于DMSO,將兩組溶液混合，控制CaP微粒與活化的大分子的摩爾比為1: 0.5?4，CaP微粒與抗癌藥物的摩爾比為1: 0.1?10，室溫環境下攪拌4?24h，組裝成載藥核心微粒，高速離心，冷凍干燥； 三、氧化還原敏感型控釋元件組裝: 取載藥核心微粒分散到濃度為I?15mg/mL的MSDS溶液中，添加EDC.HCl的水溶液和NHS，加入含有二硫鍵的控釋元件，控制載藥核心微粒與含有二硫鍵的控釋元件的摩爾比為1:1?5，載藥核心微粒與EDOHCl的質量比為1:1?5，載藥核心微粒與NHS的質量比為1:1?5，40?60°C條件下攪拌12?48h，將控釋元件組裝到載藥核心上； 四、革G向元件修飾: 取上述含有控釋元件的產物加入到濃度為0.1?lmmol/L EDTA的中性磷酸緩沖液中，含有控釋元件的產物與緩沖液的比例為1: 0.5?4 (m/v)，加入靶向分子，控制靶向分子濃度為I?20mmol/L，在室溫氮氣保護條件下反應12?48h，用去離子水透析，凍干，獲得智能型納米革G向載體。2.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法，其特征在于所述載藥核心的大分子為活化的殼聚糖、聚己內酯或聚乙稀亞胺的其中之一或任意兩者的共聚物。3.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述載藥核心運載的抗癌藥物為鹽酸阿霉素和/或siRNA。4.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述氧化還原敏感型控釋元件為巰基乙胺修飾的寡肽片段、胱氨二鹽酸鹽或二硫代二丙酸的一種。5.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述靶向分子選用腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體、雙功能肽R13或葉酸的一種。6.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革El向載體的制備方法，其特征在于所述他2即03與CaCl 2的摩爾比為1: 12?20，Na 2即03與DOPA的摩爾比為1: 0.8?4，油相中環己烷與聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的體積比為70: 20?80。7.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述CaP微粒與活化的大分子的摩爾比為1: 0.8?3.4。8.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述載藥核心微粒與含有二硫鍵的控釋元件的摩爾比為1: 1.2?4，載藥核心微粒與EDC -HCl的質量比為1: 1.2?4，載藥核心微粒與NHS的質量比為1: 1.2?4。9.根據權利要求1所述的氧化還原敏感型納米革E向載體的制備方法，其特征在于所述革巴向分子濃度為I?16mmol/L。
【專利摘要】一種氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法，屬于生物醫藥和納米材料技術領域。針對目前腫瘤載體主動靶向性能不高，體內不可降解導致沉積引發不良發應，以及對載藥的控釋效率低等問題，本發明提供一種有機-無機載藥基質相結合、對腫瘤細胞的pH值和還原性環境高度敏感的氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法。采用微乳液技術合成磷酸鈣微粒，在微粒表面涂布一層可降解的有機大分子物質形成載藥核心。把還原性環境敏感型交聯元件組裝到載藥核心上，之后接枝改性的靶向因子，最終合成智能型靶向納米微球載體。該微球載體具有靶向功能強、藥物控釋智能、結構穩定、無毒副作用等特點。
【IPC分類】A61K31/704, A61K48/00, A61K47/20, A61K9/19, A61K47/42, A61K47/18, A61P35/00
【公開號】CN105168151
【申請號】
【發明人】賀金梅, 顏廷勝, 李大龍
【申請人】哈爾濱工業大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月7日