肥1* ArgUos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl消失。反應混合物減壓濃縮至干，殘留物依次用己離 (20血X如，20血K服〇4水溶液巧％ )和&0 (20血X如研磨，得到的固體經37 〇C真空干燥48 小時重664mg，為淡黃色。直接用于下一步反應。
[0052] 實施例4制備聚天冬醜-Arg-Gly-Asp-Val(聚天冬醜-RGDV)
[0053]冰浴下將 664mg聚天冬醜-Arg(Tos) -Gly-Asp- (OBzl) -Val-OBzl溶于 6血H氣己 酸，往得到的溶液中加入2血H氣甲礙酸，攬拌90分鐘。反應混合物用己離洗（150血X3)， 殘留物溶于50血水，用化OH水溶液（2腳調抑7。得到的混濁液離必30分鐘，上層清液 用孔徑為5000的透析膜透析72小時，截留的殘留物冷凍干燥，得196mg(73% )聚天冬 醜-RGDV，為乳白色固體。[a]〇25 = -29. 00(C= 0. 01，&0)。i3cNMR(125MHz，CDCl3)dA)pm =177. 78,176. 98,175. 80,173. 89,173. 21,172. 42,171. 02,156. 79,62. 44,62. 20,60. 81, 58. 72,53. 77,51. 37,50. 61,48. 94,42. 50,40. 63,38. 12,36. 49,35. 85,34. 99,30. 73, 30. 05,28. 01,24. 53,18. 69,18. 41，17. 38,13. 48。按照數均聚合度為 173 計算，聚天冬 醜-RGDV的分子量為87985。
[0054] 實施例5測定聚天冬醜-RGDV的抗血小板聚集活性
[005引 1)制備2XIO8血小板/mL血漿
[0056] 用1 %的娃離溶液將采血容器娃焼化。在娃焼化的容器中收集豬血，按照豬血：抗 凝劑9 : 1 (體積比）加入構稼酸鋼（3.8% )抗凝，水平緩慢晃勻。將抗凝的豬血在120g 離必10分鐘，得到的上清液即是富血小板血漿（PRP)。殘留的豬血繼續在1500g離必10分 鐘，得到的上清液即是貧血小板血漿（PPP)。光學顯微鏡下觀察，用PPP調PRP使血小板數 目為2X1〇8血小板/mL血漿。
[0057] 2)測定聚天冬醜-RGDV的抗血小板聚集活性（I巧0)
[005引在血小板聚集分析儀測量管內加入240U LPRP，輕微攬拌下37C溫育10分鐘，調 零。大約1分鐘后加入5UL生理鹽水（空白對照）或西洛他哇的生理鹽水溶液（陽性對照， 終濃度為ImM)或聚天冬醜-RGDV的生理鹽水溶液（終濃度為0. 01，0. 1，1. 0,10,100yM)。 大約1分鐘后加入5ULADP的生理鹽水溶液（終濃度為500UM)或PAF的生理鹽水溶液 (終濃度為50UM)或AA的生理鹽水溶液（終濃度為7. 5mg/mL)或TE的生理鹽水溶液（終 濃度為50U/mL)。待濁度從100下降進入平臺期，記錄約6分鐘的穩定曲線為最大聚集率， 計算各種濃度下聚天冬醜-RGDV對血小板聚集的抑制率。每個濃度平行測6次，求平均值。 計算式為抑制率％ =(生理鹽水存在下的血小板聚集率-聚天冬醜-RGDV存在下的血小板 聚集率）/生理鹽水存在下的血小板聚集率。按照5種濃度聚天冬醜-RGDV存在下血小板 聚集的抑制率，計算ICe。值。用ICw表示活性，結果見表1。
[0059] 表1聚天冬醜-RGDV對ADP，PAF，AA和TH誘導的血小板聚集的影響（n=6) *
[0060]
[0061] *聚天冬氨酸未測出抗血小板聚集活性.
[006引表1的數據說明，與RGDV相比聚天冬醜-RGDV抑制ADP，PAF，AA和TE誘導的血小 板聚集的活性分別高202, 218, 2339和5844倍。可見將RGDV連接到聚天冬氨酸上，大大提 高了RGDV的抗血小板聚集活性。
[0063] 實施例6測定聚天冬醜-RGDV對GPIIb/IIIa的抑制作用
[0064] 1)制備聚天冬醜-RGDV處理的活化血小板樣品
[0065] 雄性SD大鼠（220~230g)按1200mg/kg劑量腹腔注射烏拉坦水溶液使麻醉。在 娃焼化的容器中收集大鼠動脈血，加1/9體積的構稼酸鋼（3.8% )抗凝，水平緩慢晃勻， 120g離必10分鐘，取上清液，得到PRP血漿。向96UL血漿中加入2UL聚天冬醜-RGDV 的生理鹽水溶液（終濃度50nM)，賠育5分鐘，加2ULAA的生理鹽水溶液（終濃度7. 5mg/ 血），37°C溫育3分鐘。
[0066] 2)測定聚天冬醜-RGDV對GPIIb/IIIa抑制作用
[0067] 按照GPnb/IIIaELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）的標準方法，96孔 板室溫平衡20分鐘，設置標準品孔和聚天冬醜-RGDV孔。繪制標準曲線用的標準品孔先 加50UL試劑盒的標準溶液（終濃度為1600,800,400, 200,100和Ong/mL)，再加IOOiiL 辣根過氧化物酶標記的檢測抗體。聚天冬醜-RGDV孔先加96ULPRP血漿和10UL聚天冬 醜-RGDV的生理鹽水溶液（終濃度50nM)，37 °C賠育5分鐘，再加2ULAA的生理鹽水溶液 (終濃度7. 5mg/mL)，37 °C溫育3分鐘，后加40UL試劑盒的樣本稀釋液。RGDV孔先加96UL PRP血漿和10ULRGDV的生理鹽水溶液（終濃度25mM)，37°C賠育5分鐘，再加2ULAA的 生理鹽水溶液（終濃度7. 5mg/mL)，37 °C溫育3分鐘，后加40UL試劑盒的樣本稀釋液。空 白孔孔先加96ULPRP血漿和10UL生理鹽水，37°C賠育5分鐘，再加2ULAA的生理鹽水 溶液（終濃度7. 5mg/mL)，37°C溫育3分鐘，再加40UL試劑盒的樣本稀釋液，后加100UL 試劑盒的辣根過氧化物酶標記的檢測抗體。96孔板用封板膜封孔，37C賠育60分鐘。每個 孔重復3次。
[006引 3)洗板/顯色和測定
[0069] 各孔棄去溶液后在吸水紙上拍干，加滿試劑盒的洗涂液，靜置1分鐘。甩去洗涂液 后在吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。各孔加入50UL試劑盒的底物A和50UL試劑盒 的底物B，37°C避光賠育15分鐘。向各孔加50UL試劑盒的終止液，15分鐘內在450nm波 長處測定各孔的OD值。根據標準曲線計算GPIIb/IIIa的量，結果見表2。可見將RGDV連 接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDV抑制GPHb/IIIa的活性。
[0070] 表2聚天冬醜-RGDV對GPIIb/IIIa抑制作用*
[0071]
[007引 *聚天冬醜-RGDV的濃度為50nM，RGDV的濃度為25mM，n= 3.a)與NS組比P < 0. 05.
[0073] 表2的數據說明，聚天冬醜-RGDV可有效地抑制GPHb/IIla。與RGDV相比聚天冬 醜-RGDV抑制AA活性的血小板上GPnb/IIIa的活性是RGDV的50萬倍。可見將RGDV連 接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDV對GPHb/IIIa的抑制活性。
[0074] 實施例7測定聚天冬醜-RGDV的抗血栓活性 [007引 1)給藥
[0076] 雄性SD大鼠（220~230g)分別口服生理鹽水（3ml/kg)，阿斯匹林的生理鹽水溶 液（167Umol/kg)，聚天冬醜-RGDV的生理鹽水溶液（Inmol/kg)，RGDV的生理鹽水溶液（劑 量為Symol/kg)，W及聚天冬氨酸（Inmol/kg)和RGDV(InmolAg)的混合物的生理鹽水溶 液。各10只大鼠，30分鐘之后進行下面的手術。
[0077] 2)大鼠手術與插管
[0078] 雄性SD大鼠（220~230g)按1200mg/kg劑量腹腔注射烏拉坦溶液進行麻醉。麻 醉大鼠仰邸位固定，分離右頸總動脈，于近必端夾動脈夾，近必端和遠必端分別穿入手術 線，將遠必端的手術線于皮毛用止血謝夾緊，準備在遠必端插管。
[0079] 插管為娃焼化過的聚己帰膠管，分H段。中段為聚己帰膠管，長6畑1，內徑3. 5mm。 另外兩段聚己帰管，長10cm，內徑1. 0mm，外徑2. 0mm。它們的一端拉成外徑為1.Omm的尖管 (用于插入大鼠頸動脈或靜脈）。將編好號的干凈青霉素小瓶中分別裝入6cm長的娃焼化 黑色手術線，稱重，放入中段插管中。
[0080] 打開大鼠右側動脈夾，用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液巧OIU/ kg)，然后將插管的動脈端插入大鼠右側頸總動脈，將計算量的肝素緩緩注入大鼠體內。夾 閉右側頸動脈夾，將插管的靜脈端插入分離好的大鼠左側頸靜脈，打開動脈夾，使血液開始 循環。并同時開始計時15分鐘。
[0081] 3)血栓稱重
[0082] 15分鐘后，剪斷動靜脈插管，停止循環，用眼科綴小必取出絲線，在濾紙上輕輕廳 掉血滴，放入事先稱重好的青霉素小瓶中，精確稱重并記錄，計算的血栓濕重代表活性，結 果見表3。
[0083] 表3聚天冬醜-RGDV對在大鼠曲栓形成的影響*
[0084]
[00財袖=10 ;a)與生理鹽水和聚天冬氨酸+RGDV比P< 0.Ol;b)與阿司匹林比P> 0. 05.
[008引表3的數據說明，聚天冬醜-RGDV可有效地抑制大鼠形成血栓。與阿司匹林相比 聚天冬醜-RGDV的活性是阿司匹林的167000倍。可見將RGDV連接到聚天冬氨酸上，大大 提高了RGDV對大鼠形成血栓的抑制活性。
[0087]實施例7測定聚天冬醜-RGDV的血栓祀向作用
[008引收集實施例6中接受聚天冬醜-RGDV治療的大鼠的500mg血液加ImL構稼酸鋼 的水溶液（3. 8% )抗凝，4°C和3000g離必10分鐘，上清液與2血甲醇充分混合，于4°C和 12000g離必10分鐘，取10UL進樣測定FT-MS。在血液提取物的質譜圖中沒有發現任何與 聚天冬醜-RGDV相關的峰（圖2)。測定結果說明，聚天冬醜-RGDV抑制大鼠血栓形成時，快 速在血液中消失、不釋放RGDV、不代謝。
[0089]收集實施例6中接受聚天冬醜-RGDV治療的大鼠插管中的50mg血栓先用2mL高 純水洗，然后用2mL高純水制備勻漿。得到的勻漿于4°C和3000g離必10分鐘，上清液與 2血甲醇充分混合，于4°C和12000g離必10分鐘，取10UL進樣測定FT-MS。在血栓提取物 的質譜圖中看到RGDV加H的峰（446. 34043,圖3)。測定結果說明，聚天冬醜-RGDV抑制大 鼠血栓形成時，快速進入血栓并釋放RGDV。可見，聚天冬醜-RGDV具有血栓祀向作用。
【主權項】
1. 血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV。2. 根據權利要求1血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV，其特征在于：所 述聚天冬氨酰-RGDV的聚天冬氨酰的聚合度為173。3. 制備權利要求1血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV方法，該方法包括 下面四個步驟。 (1) 采用液相合成方法，逐步接肽合成HCl?Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl; (2) 聚合度為173的聚天冬氨酸的制備方法； (3) 把HCl.Arg(T0s)-Gly-AsP(OBzI)-Val-OBzl連接到聚合度為173的聚天冬氨酸的 側鏈羧基上，制備聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl; (4) 脫去聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl的保護基。4. 權利要求1血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV在制備抗血栓藥物中 的用途。
【專利摘要】本發明涉及血栓靶向的聚天冬酰-RGDV，涉及它的制備方法，涉及它的納米結構，涉及它在大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本發明闡明了聚天冬酰-RGDV作為靶向抗血栓劑的臨床應用前景。本發明屬于生物醫藥領域。
【IPC分類】A61P7/02, C08G73/10, A61K47/48, A61K38/07
【公開號】CN105169401
【申請號】
【發明人】趙明, 彭師奇, 王玉記, 吳建輝, 陳雙玲
【申請人】首都醫科大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2014年6月19日