靶向免疫治療胰腺癌的載藥納米微粒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及用于治療膜腺癌的祀向載體、納米微粒及其應用
【背景技術】
[0002] 膜腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發病隱匿、易轉移、長期生存率低的特 點。根治性手術切除是治療膜腺癌的首選方法，但大多數膜腺癌患者確診時已屬晚期，手術 切除率<20 %，化療是主要治療手段，但由于腫瘤化療耐藥的存在，化療藥物效果不甚理想， 開發新的藥物W更有效地治療膜腺癌是臨床迫切需要解決的問題。自1997年起，吉西他濱 是臨床抗膜腺癌治療的一線藥物，但在遠期療效和預后方面并未取得突破性進展，其原因 可能與腫瘤細胞對吉西他濱耐藥有關。B淋己瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入區1度lymphoma Moloneymurineleukemiavirusinse;rtionregion 蛋白在人類多種惡性腫瘤 中高表達，如頭頸部腫瘤、乳腺癌、膜腺癌，其表達與腫瘤的發生發展有關。Bmi-I參與細胞 周期、干細胞增殖、分化與衰老的調控，也可W誘導細胞的早期轉化。研究表明抑制Bmi-I 的表達可W抑制膜腺癌細胞的增殖，甚至可W逆轉膜腺癌細胞的惡性特性、增加膜腺癌細 胞的藥物敏感性。SiRNAs(smallinte計erenceRNA)誘導的RNA干擾是特異性沉默祀基因 的有利工具，但是缺乏有效載體限制了其體內應用。目前聚乙締亞胺（polyet的leneimine， PEI)是最為廣泛應用的納米載體，其具有陽性電荷，能與帶陰性電荷的細胞膜結合，獲得 較高的轉染率，從而將SiRNA帶入細胞內發揮作用。將吉西他濱和生物祀向藥物聯合應用 來提高療效和降低反應毒性是近年來研究最為活躍的領域之一。聯合使用SiRNAs和化療 藥物，將化療和基因治療聯合應用得到更強大、更持久的協同抗腫瘤作用。利用納米材料 將化療藥物包封，和包載SiRNAs的納米載體同時輸送至胞內，可減低藥物的急性毒性并 提高療效。另外，納米載體還可W偶聯抗體，利用抗體祀向識別抗原的特性，將包載的基 因或藥物祀向輸送到腫瘤細胞，在增強抗瘤效應的同時減低對正常組織細胞的非特異毒 性。IONP(ma即eticironoxidenanoparticles)是一種能向細胞輸送藥物且具有磁共 振（ma即eticresonanceimaging,MRI)成像功能的載體。膜腺癌細胞高表達抗粘附因子 CD44v6,可作為識別膜腺癌的標祀。抗CD44v6單鏈抗體（theanti-CD44v6singlechain vari油Iefragment,scFvCD44v6)具有高度親和力和祀向性，能夠祀向地識別膜腺癌細胞。 發明人前期研究表明，載藥（基因）納米微粒與單鏈抗體進行交聯制成免疫納米微粒，可提 高藥物對腫瘤細胞的選擇性，達到提高療效、降低毒副作用的目的。
【發明內容】
[0003] 本發明提供了一種用于治療膜腺癌的祀向載體，其包括：用于祀向識別膜腺癌 細胞的CD44v6單鏈抗體、W及納米載體IONP-PEI;其中CD44v6單鏈抗體與納米載體 IONP-PEI偶聯。CD44v6單鏈抗體與納米載體IONP-PEI偶聯后在體內外均能夠祀向地識別 膜腺癌細胞。
[0004] 另一方面，本發明提供了一種用于治療膜腺癌的納米微粒，其包括前述祀向載體、 W及沉默RNA，其中，沉默RNA搭載于前述祀向載體上。
[000引具體而言，沉默RNA為Bmi-I基因的沉默RNAs,即SiBmi-I。該搭載了SiBmi-I的 納米微粒可沉默膜腺癌細胞Bmi-I基因表達，引起Panc-I細胞克隆形成能力減弱、細胞周 期阻滯、增殖受抑、遷移和侵襲減少。
[0006] 進一步地，納米微粒包括吉西他濱化療藥物（W下簡稱吉西他濱），吉西他濱與 SiBmi-I共載（復合）于膜腺癌祀向載體上。該共載了吉西他濱和SiBmi-I的納米微粒可 有效地沉默Bmi-I基因表達，誘導細胞調亡，在抑瘤方面具有協同效應。
[0007] 本發明構建了高效、安全、具有祀向功能的非病毒基因載體。將SiRNAs和吉西他 濱通過納米載體偶聯，并且與抗CD44V6單鏈抗體偶聯，將基因治療、化療和生物祀向治療 聯合應用，為抗膜腺癌新型藥物研發提供了新思路和科學依據。
【附圖說明】
[0008] 圖1為實施例1中，N/P比值為20時IONP-PEI(非祀向組）和scFv-IONP-PEI(祀 向組）轉染Panc-I細胞后巧光顯微鏡下觀察；
[0009] 圖2為實施例1中，scFv-IP/siRNAs納米微粒的細胞內吞及在細胞內的分布， Fnc-標記的小鼠抗人6XHistag抗體特異性與scFvcd44v為合，因此內吞scFv-IP/siRNAs 的Panc-I細胞在巧光顯微鏡下呈綠色巧光；
[0010] 圖3為實施例1中，N/P比值為20時IONP-PEI(非祀向組）和scFv-IONP-PEI(祀 向組）的轉染率，（*vslipo，#vsscFv-I0NP-PEI，P<0. 05);
[0011] 圖4為實施例I中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1轉染Panc-I細胞后對細胞 增殖的影響；
[001引 圖5為實施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1轉染Panc-I細胞后對細胞 克隆形成能力的影響；
[001引 圖6為實施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1轉染Panc-I細胞后對細胞 遷移、侵襲能力的影響；
[0014]圖7為實施例1中的活體巧光呈像：IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs在體內不同時 間段的分布（小鼠尾靜脈注射IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs后不同時間點巧光物質在體 內的分布）；
[001引圖8為實施例1中的離體巧光呈像：小鼠尾靜脈分別注射IP/siRNAs和SCFv-IP/ SiRNAs后，48小時后將小鼠安樂死，取出各組織器官進行離體組織呈像；
[001引圖9為實施例2中，scFv-Gem-IONP復合物的透射電鏡圖；
[0017]圖10為實施例2中，scFv-Gem-IONP復合物中吉西他濱釋放曲線；
[001引 圖11為實施例2中，Panc-I細胞經過不同處理組后細胞毒性（Gem,Gem-IONP,scFv-Gem-IONP，scFv-Gem-IONP/siBmi-1在不同濃度作用于Panc-I細胞后對細胞的殺傷 作用）；
[0019] 圖12為實施例2中，不同處理組裸鼠移植瘤組織學檢查，小鼠尾靜脈注射PBS (control)、IP-SCR、IP-SiBmi-I及scFv-IP-siBmi-1后，實驗終點將各組移植瘤組織進行 Bmi-I染色檢測各組織Bmi-I蛋白表達情況檢測各組體內沉默Bmi-I表達情況；
[0020] 圖13為實施例2中，不同處理組裸鼠移植瘤組織學檢查，小鼠尾靜脈注射 PBS(^control)、Gem、Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1，實驗終點將各組 移植瘤組織進行Bmi-1、Bd-2、Bax染色檢測各組Bmi-I基因沉默效果及調亡相關蛋白表 達。
【具體實施方式】
[00川 實施例1
[0022] 本實施例的祀向載體包括CD44v6單鏈抗體、W及納米載體IONP-PEI，其搭載了 SiBmi-I。本實施例的內容包括實驗方法和結論分析兩部分。
[002引一、實驗方法[0024] 1、細胞培養
[00巧]人膜腺癌細胞株Panc-I在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，恒溫37°C，5%CA培養箱中培養。
[002引 2、祀向載體構建
[0027] scFvCD44v6(CD44v6 單鏈抗體）按照中國專利 2011102402903、2011102402871 所 披露的方法合成。scFvCD44v6與陽I按質量比1 :1偶聯，過程簡述如下：
[002引①按照比例制備IONP-PEI復合物，將mal-陽G-N服溶于滅菌去離子水，與scFv按 照摩爾比為1:10加入復合物中，混勻，室溫解育30min;
[0029] ②將已制備的scFvCD44v6與PEI按照質量比為1:1加入上述復合物中，4°C過夜；
[0030] ③使用前5邸的MILLIP0RE超濾離屯、管3000r/min離屯、IOmin去除游離的抗體， 得到純化的祀向載體scFv-IONP-PEI(scFv-IP)。
[00引]3、scFv-IP/siRNAs復合物（搭載SiBmi-I的祀向載體）的制備
[0032] 按IONP質量為5yg，IONP和PEI質量比為0. 75,制備IONP-PEI復合物；按照不 同的N/P比值，將一定量的SiRNAs溶液與IP溶液在去離子水中輕輕混勻（中號加樣槍輕 輕吹吸5次），室溫靜置解育20分鐘，即得到不同N/P值的IP/siRNAs復合物。
[0033] 4、巧光顯微鏡觀察scFv-IP/siRNAs納米微粒在細胞內的分布
[0034] (1)分別WIP/siRNAs、scFv-IP/siRNAs轉染Panc-I細胞，具體過程如下：
[0035] A、Panc-l細胞接種在24孔板，5X10シ孔，無抗生素完全培養基中貼壁生長24小 時。
[0036]B、SiRNAs濃度為lOOnmol/L。按N/P比值=20 制備IP/FAM-siRNAs復合物，混勻 后室溫靜置20分鐘，然后加入100y1轉染專用培養基化ti-MEM中混勻。
[0037]C、棄去24孔板中舊DMEM培養基，每孔加入400ul新鮮的無血清DMEM培養基。然 后將上述100y1混合物逐滴加入孔板中，輕輕搖勻。37°C，5%C〇2培養箱中培養。
[0038]D、為觀察IP/FAM-siRNAs復合物在Panc-I細胞內的分布情況，轉染6小時后，去 除舊培養基，PBS輕輕洗細胞一遍后，加入ImlPBS。然后在巧光顯微鏡下觀察細胞巧光圖 像。避光操作。
[003引似轉染6小時后，棄去舊培養基，WPBS洗立次，每孔加入SOOiil多聚甲醒 (4%)室溫固定5分鐘。
[0040] (3)PBS輕輕洗細胞2次。
[0041] (4)每孔加入200y1 1%BSA/PBS，室溫下低速搖床封閉30min。
[004引（5)去除封閉液，PBS輕輕洗細胞2次。
[004引（6)解育二抗。加入FITC標記小鼠抗6X化Stag單克隆抗體（IOyg/ml)，室溫 下低速搖床、避光解育30min。
[0044] (7)去除二抗，加入PBS輕輕洗細胞2次。
[0045] (8)染核。Hoechest33342 工作液染核Smin。
[0046] 巧)PBS輕輕洗細胞2次。加入少量PBS，然