一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物載體的制備方法領域，特別設及一種透明質酸祀向的多功能支化 聚乙締亞胺藥物載體的制備方法。
【背景技術】
[0002] 癌癥一直被認為是人類需要攻克的重大難題之一。化學藥物治療作為癌癥治療 的重要手段之一，長期W來倍受關注。然而常見的抗腫瘤藥物存在著水溶性差、毒副作用 大，藥物釋放快，抗腫瘤藥物無法集中于腫瘤部位，造成患者正常組織和器官也受到損害 等問題。近年來，利用納米材料作為載體負載抗腫瘤藥物，可顯著增加藥物水溶性、實現 藥物緩釋，延長藥物在腫瘤部位的作用時間；同時通過修飾祀向分子使藥物祀向識別腫瘤 部位，從而能有效的聚集在腫瘤部位，實現更好的腫瘤治療效果，減少毒副作用（Wanget al.，Macromol.Biosci. 2007, 7, 1187-1198)。因此，研究一種新型的納米藥物緩釋體系是目 前納米醫學的研究熱點。
[0003] 支化聚乙締亞胺（PEI)是一種分子量較大的支鏈狀PEI，內部有疏水的空腔，具 有支化的=維結構，表面具有大量帶正電荷的氨基，為其進一步化學修飾提供了條件，而 且PEI商業化程度高，價格低廉，可W作為一種良好的藥物載體。Wen等系統地研究了支化 PEI的表面氨基的各種修飾，如乙酷化、徑基化、簇基化及聚乙二醇化（Wenetal.，J.Appl. Polym.Sci. 2013, 128(6)，3807-3813)。聚乙二醇（PEG)是一種具有良好生物相容性的鏈狀 聚合物，將其修飾到PEI表面能夠提高材料的水溶性和生物相容性，同時能延長藥物緩釋 周期。透明質酸（HA)，是一種具有良好水溶性的高分子聚合物，是脊椎動物組織和體液的主 要成分。此外，HA可W作為一種生物祀向分子，能與腫瘤細胞表面過度表達的CD44受體分 子特異性結合。通過HA與腫瘤細胞表面CD44受體分子的特異性結合可實現藥物緩釋體系 對腫瘤細胞的特異性識別與主動富集，實現腫瘤的特異性的祀向治療。
[0004] 查閱國內外相關文獻或專利，合成透明質酸祀向的聚乙締亞胺作為藥物載體用于 抗腫瘤藥物輸送與腫瘤祀向治療的研究尚未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種透明質酸祀向的多功能支化聚乙締亞胺 藥物載體的制備方法，該藥物載體負載DOX得到的PEI-FI- (PEG-HA) /DOX納米藥物緩釋體 系具有良好的藥物緩釋效果，對CD44受體表達的腫瘤細胞具有顯著的祀向性和明顯的抑 制效果，用于癌細胞的祀向治療。
[0006] 本發明的一種透明質酸祀向的多功能支化聚乙締亞胺藥物載體的制備方法，包 括：
[0007] (1)在聚乙二醇畑2-PEG-C00H的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽邸C溶液，攬拌，然后加入N-徑基下二酷亞胺N服的溶液，攬拌，得到混合溶液； 將混合溶液滴加到聚乙締亞胺陽I溶液中，攬拌反應3天，透析，冷凍干燥，得到末端為氨基 的陽G修飾的聚乙締亞胺陽I-PEG;其中，PEI與畑2-PEG-C00H的摩爾比為1:20 ;
[0008] (2)在透明質酸HA溶液中加入邸C溶液，攬拌，加入N服溶液，攬拌，得到混合液； 將混合液滴加到步驟（1)中PEI-PEG的溶液中，攬拌3~4天，透析，冷凍干燥，得到HA修 飾的聚乙締亞胺陽I-(PEG-HA);其中，PEI-PEG與HA的摩爾比為1:30 ;
[0009] (3)將異硫氯酸巧光素FI溶液逐滴加入到步驟（2)中陽I-(PEG-HA)的水溶液 中，在避光條件下，攬拌反應20-30小時，透析，冷凍干燥，得到PEI-FI-(PEG-HA);其中 陽I-(PEG-HA)與FI的摩爾比為1:10。
[0010] 所述步驟（1)中畑2-PEG-C00H的溶液、EDC溶液和N服溶液的溶劑均為二甲基亞 諷。 陽0川所述步驟（1)中畑2-PEG-C00H溶液的濃度為10-15mg/mL，邸C溶液的濃度為 10-15mg/mL，N服溶液的濃度為IO-ISmg/血，PEI溶液的濃度為2-4mg/血。 陽01引所述步驟（1)中加入邸C后，攬拌的時間為15~30分鐘；加入畑S后攬拌的時間 為3~4小時。 陽01引所述步驟（1)中邸C與畑2-PEG-C00H的摩爾比為10:1 ;EDC與N服的摩爾比為1:1。
[0014] 所述步驟（1)中的透析為采用的膜為纖維素透析膜，截留分子量MWCO為 8000-14000,在憐酸鹽緩沖溶液PBS中透析2天。
[0015] 所述步驟（1)中畑2-PEG-C00H的分子量為2000g/mol，陽I的分子量為25000g/ mol。
[0016] 所述步驟似中陽I-PEG溶液的濃度為2-4mg/mL，HA溶液的濃度為3-8mg/mL。
[0017] 所述步驟似中加入邸C后攬拌的時間為20~30分鐘；加入畑S后攬拌的時間 為3~4小時。 陽0化]所述步驟似中邸C與HA的摩爾比為1:3 ;EDC與N服的摩爾比為1:1。
[0019] 所述步驟（2)中HA的分子量為5805g/mol。
[0020] 所述步驟（2)和步驟（3)中溶液采用的溶劑均為超純水。
[OOW 所述步驟似和步驟做中透析采用的膜為纖維素透析膜，截留分子量MWCO為 8000-14000,在去離子水中透析2天。
[0022] 所述步驟（1)、步驟（2)和步驟（3)中攬拌為磁力攬拌，攬拌速度為100-150轉/ 分鐘。
[0023] 所述步驟（3)中得到的PEI-FI-(PEG-HA)作為藥物載體用于抗腫瘤藥物輸送與腫 瘤祀向治療的研究。
[0024] 所述步驟（3)中得到的PEI-FI-(PEG-HA)負載阿霉素DOX作為納米藥物緩釋體系 用于癌細胞的祀向治療。 陽0巧]所述步驟（3)中PEI-FI- (PEG-HA)負載阿霉素DOX作為納米藥物緩釋體系具有良 好的藥物緩釋效果，對CD44受體表達的腫瘤細胞具有顯著的祀向性和明顯的抑制效果。 陽0%] 所述陽I-FI- (PEG-HA)負載阿霉素DOX的方法包括：將鹽酸阿霉素值0訝溶于甲 醇溶液中，加入S乙胺，逐滴加入陽I-FI-(PEG-HA)水溶液，攬拌12-24小時，離屯、，冷凍干 燥得到負載阿霉素的透明質酸修飾的聚乙締亞胺藥物緩釋體系PEI-FI-(PEG-HA)/DOX;其 中陽I-FI-(PEG-HA)與DOX的摩爾比為1:20,攬拌反應時為開放體系。
[0027] 所述S乙胺與PEI的摩爾比是5:1。
[0028] 所述離屯、的速率為8000-10000轉/分鐘，時間為5-10分鐘。
[0029] 支化聚乙締亞胺（PEI)內部有疏水的空腔，具有支化的=維結構，表面具有大量 帶正電荷的氨基，為其進一步化學修飾提供了條件，而且陽I商業化程度高，價格低廉，可 W作為一種良好的藥物載體。聚乙二醇（PEG)是一種具有良好生物相容性的鏈狀聚合物， 將其修飾到PEI表面能夠提高材料的水溶性和生物相容性，同時能延長藥物緩釋周期。透 明質酸（HA)，是一種具有良好水溶性的高分子聚合物，是脊椎動物組織和體液的主要成分。 此外，HA可W作為一種生物祀向分子，能與腫瘤細胞表面過度表達的CD44受體特異性結 合。通過HA與腫瘤細胞表面CD44受體的特異性結合可實現藥物緩釋體系對腫瘤細胞的特 異性識別與主動富集，實現腫瘤的特異性的祀向治療。
[0030] 本發明所得到的負載阿霉素的透明質酸祀向的聚乙締亞胺的納米藥物緩釋體系 陽I-FI-(PEG-HA)/DOX能夠有效控制阿霉素的釋放，并且可W通過透明質酸的主動祀向 CD44受體，顯著提高對特異腫瘤細胞的抑制作用，應用前景廣闊。 陽03U 本發明使用核磁共振氨譜伯NMR)、紫外一可見光分光光度計扣V-Vis)、Zeta電 勢測量等方法表征本發明制備的透明質酸祀向的多功能支化聚乙締亞胺負載阿霉素的納 米藥物緩釋體系，同時用MlT法、流式細胞術分析和激光共聚焦顯微鏡來檢驗所制備的納 米藥物緩釋體系對表面高表達CD44受體的子宮頸癌細胞化eLa細胞）的毒性與祀向性。 [0032] 本發明采用價廉易得的聚乙締亞胺分子陽I為載體，HA為祀向試劑，降低了材料 的成本，對生物體無不良影響，制備方法簡單，條件溫和，易于操作，具有良好的應用前景。 陽的引 有益效果
[0034] (1)本發明的PEI-FI- (PEG-HA)負載DOX得到的載藥納米顆粒具有良好的水溶性 和生物相容性，較好的藥物緩釋效果與pH響應性釋放特性，對高CD44受體表達的腫瘤細胞 具有祀向性和明顯的抑制效果，可用于癌細胞的祀向治療；
[0035] (2)本發明制備方法簡單，反應條件溫和，成本低廉，易于操作，具有產業化實施的 前景。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發明制備陽I-FI-(PEG-HA)/DOX合成示意圖；
[0037] 圖2為實施例1中陽I-PEG (a)和陽I-(PEG-HA)化）核磁共振氨譜圖；
[0038] 圖3為實施例1中陽I-FI-(PEG-HA)的紫外吸收光譜圖；
[0039] 圖4為實施例2中陽I-FI- (PEG-H