48小時。然后加入AR16(34mg)繼續攪拌12小時。反應粗產物在水中透析24小時除去雜質，冷凍干燥。經1H NMR分析，P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)中CPT與AR16的摩爾百分比分別為10.5%和1.5%。經GPC測定，P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)分子量Mn=23，600，分子量分布^/^= 1.14。P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)的核磁氫譜如圖2所示。由于CPT具有藍色熒光，其熒光激發與發射光譜如圖3所示。
[0074]實施例2
[0075]P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)納米藥物溶液的制備:
[0076]取1mg P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)溶于 ImL DMSO 中，將溶液滴入 9mL 攪拌的水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為7，OOODa)中透析24小時，除去有機溶劑，即得納米藥物溶液。其粒徑約85.8nm(±1.56)(見圖4)，電勢-4.5mV(±0.18)。
[0077]實施例3
[0078]納米空載體及靶向納米前藥細胞毒性實驗
[0079]選取去勢抵抗性前列腺癌代表性細胞株DU145，將培養好的DU145細胞以5000個/孔的密度種在96孔板中。24小時后，加入不同濃度的納米空載體及靶向納米前藥，分別觀察并記錄48小時和72小時后的細胞存活率。細胞毒性實驗表明，納米空載體P (OEGMA-co-BSMA)在較高的濃度下依然具有良好的生物相容性(見圖5)。靶向納米前藥P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)可在較低劑量條件下有效地殺傷DU145細胞(見圖6)。
[0080]實施例4
[0081]靶向納米前藥的靶向性檢測
[0082]選取去勢抵抗性前列腺癌代表性細胞株DU145，將培養好的DU145細胞以5000個/孔的密度種在共聚焦專用培養皿中。24小時后，加入10 μ M CPT當量的自由CPT、非靶向納米前藥和靶向納米前藥，培養2小時后用激光共聚焦觀察各組細胞內CPT熒光強度。納米化的前藥進細胞能力較自由CPT明顯提升，而修飾有AR16肽的納米前藥進細胞能力較非靶向納米藥物明顯增強，說明AR16肽改性的納米前藥對去勢抵抗性前列腺癌有特異性識別作用，會導致更多的藥物分子進入癌細胞內發揮藥效。
[0083]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1.一種用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥，其為P(0EGMA-CO-CPT-CO-AR16)。2.一種根據權利要求1所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，包括以下步驟: (1)制備中間產物P(OEGMA-co-BSMA): 將一定量可逆加成斷裂鏈轉移引發劑三硫代酯BPTPA、寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯0EGMA、含β -硫代羧基的單體BSMA、溶劑和自由基引發劑加入玻璃管中，真空凍融三次后封管；之后，在20-80°C條件下反應0.5-40小時，得粗產物P(OEGMA-co-BSMA);最后將該粗產物 P (OEGMA-co-BSMA)純化處理得所述 P (OEGMA-co-BSMA)； (2)制備目標產物P (0EGMA-co-CPT-co-AR16): 將一定量P (OEGMA-co-BSMA)、N-羥基丁二酰亞胺、CPT、縮合劑和催化劑溶于有機溶劑中，于反應容器內室溫攪拌1-72小時；然后，加入一定量AR16繼續反應1-48小時，得粗產物 P(0EGMA-co-CPT-co-AR16);最后將該粗產物 P (0EGMA-co-CPT-co_AR16)純化處理得所述目標產物 P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)。3.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述純化處理為:水中透析，然后冷凍干燥。4.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的所述OEGMA的分子量為200-50000。5.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的所述溶劑選自DMF、DMS0、NMP、異丙醇、甲醇、乙醇、二氧六環和四氫呋喃中的一種或多種。6.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的所述自由基引發劑選自過氧化環己酮、過氧化二苯甲酰、叔丁基過氧化氫、偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈中的一種或多種。7.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的所述BPTPA:0EGMA: BSMA:自由基引發劑的摩爾比為1:10-500:0.5-500:0.0l-108.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的所述縮合劑選自二環己基碳二亞胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N，N’- 二異丙基碳二亞胺(DIC)中的一種或多種。9.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制備方法，其特征在于，所述步驟⑵中的所述催化劑選自吡啶、二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺和羥基苯并三氮唑中的一種或多種。10.根據權利要求2所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的制s備方法，其特征在于，所述步驟⑵中的所述P(OEGMA-co-BSsMA)中的BSMA:N_羥基丁二酰亞胺:CPT:縮合劑:催化劑:AR16 的摩爾比為 I:0.01-0.1:0.1-0.99:1-10:0.01-0.5:0.01-0.1。11.一種根據權利要求1所述的用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥的納米制劑，其特征在于，其中的納米粒子的粒徑為10?2000nm，包含的所述革El向前藥為P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)。12.—種根據權利要求11所述的納米制劑，其特征在于，所述納米制劑為納米藥物溶液，其中，所述P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)的摩爾濃度為0.0001-300 μmol/L，所述P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)經過人體內代謝后，釋放的活性拓撲異構酶I抑制劑CPT的摩爾濃度為0.001-10000 μ mol/L，且含的多肽序列AR16的摩爾濃度為0.0001-100 μ mol/L013.一種根據權利要求12所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，選自以下方法中的一種:復乳法，薄膜乳化法，乳化蒸發法，界面沉淀法，自組裝法。14.根據權利要求13所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述制備方法為復乳法，包括步驟:將所述P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)溶于二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，超聲乳化，再加入到水分散介質pluronic F68中，再次超聲乳化，然后室溫下攪拌0.5-5小時，除去有機相，即得納米藥物溶液。15.根據權利要求13所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述制備方法為薄膜乳化法，包括步驟:將所述P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)溶于丙酮中，旋轉蒸發成膜，隨后加入水溶液，室溫下攪拌0.5-6小時，即得納米藥物溶液。16.根據權利要求13所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述制備方法為乳化蒸發法，包括步驟:將所述P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)溶于丙酮/ 二氯甲烷的混合溶劑中，加入到含聚乙烯醇的水分散介質中，進行超聲或高壓乳勻乳化，所得乳液在室溫下攪拌2-4小時，揮盡有機溶劑，即得納米藥物溶液。17.根據權利要求13所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述制備方法為界面沉淀法，包括步驟:將所述P(0EGMA-co-CPT-co-AR16)溶于丙酮中，在不斷攪拌條件下，將所得丙酮溶液注入到含聚乙烯醇的水分散介質中，加壓揮發去除丙酮，即得納米藥物溶液。18.根據權利要求13所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述制備方法為自組裝法，包括步驟:將所述P (0EGMA-co-CPT-co-AR16)溶于DMSO中，將所得溶液滴入一定量攪拌著的水中，之后將溶液裝入透析袋中透析除去有機溶劑，即得納米藥物溶液。19.根據權利要求14或16中所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述超聲的強度為10-1000W。20.根據權利要求18所述的納米藥物溶液的制備方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量的范圍為1000-100000Da。21.根據權利要求14、16、17中任一項所述的水分散介質的質量體積百分濃度為0.01-10%。22.—種根據權利要求11所述的納米制劑，其特征在于，所述納米制劑為納米凍干劑，其中，凍干支架劑選自海藻糖、葡萄糖、乳糖、煎糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇中的一種或多種，且所述凍干支架劑的質量百分濃度為0.01-20%。
【專利摘要】本發明提供了一種用于治療去勢抵抗性前列腺癌的靶向前藥，其為P(OEGMA-co-CPT-co-AR16)；其中，POEGMA為具有長循環功效的水溶性高分子，CPT為具有抗腫瘤活性的化療藥物喜樹堿，AR16為能夠對去勢抵抗性前列腺癌特異性靶向的多肽；還提供了制備P(OEGMA-co-CPT-co-AR16)的方法，即以含有-硫代羧基的高分子P(OEGMA-co-BSMA)為基礎，采用酯化與氨解反應將CPT和AR16共價改性到聚合物上，得到靶向性CPT大分子前藥P(OEGMA-co-CPT-co-AR16)。此外，本發明還提供了所述靶向前藥的納米制劑及其制備方法。采用本發明所述方法制備的P(OEGMA-co-CPT-co-AR16)靶向前藥納米制劑，可在較低劑量條件下有效地殺傷癌細胞，并且對去勢抵抗性前列腺癌具有優異的特異性識別作用。
【IPC分類】A61K31/4745, A61K9/19, A61P35/00, A61K47/48
【公開號】CN105169404
【申請號】
【發明人】殷佩浩, 劉濤, 袁易, 彭文, 袁夏, 賈婷婷, 邱艷艷, 鄒瑜, 石曉靜, 于卉
【申請人】上海市普陀區中心醫院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月2日