情況:1.亂序對照組；2.NF-kB基因敲減組；3.NF-kB合并RIZl雙敲減組。
【具體實施方式】
[0012]為了更全面地理解和應用本發明，下面結合具體實施例，做進一步說明。
[0013]—、NF-kB抑制劑在腫瘤細胞中對該分子活性的作用
[0014]在腫瘤細胞HepG2 中，NF_kB 用其抑制劑 Pyrrolidine dith1carbamate (PDTC)處理。I3DTC濃度為lOOmicromolar。處理時間為12小時。Western-blotting實驗顯示在PDTC處理的情況下，NF-kB細胞核中量下降，說明NF-kB活性下降(圖1)。
[0015]二、構建NF-kB基因敲減及亂序對照的腫瘤細胞系
[0016]根據NF-kB p65的基因序列，我們設計出含有如下干擾序列GGACATATGAGACCTTC的shRNA，我們同時設計了含亂序對照序列GCTCGCCTGTCTACTAACT的shRNA，并將兩種shRNA分別轉入pLK0.1質粒載體，在293FT細胞上包裝增殖成慢病毒。用含有shRNA的慢病毒對腫瘤細胞ifepG2進行感染，并于感染72小時后進行嘌呤霉素篩選，建立穩定的NF-kB基因敲減及亂序對照的腫瘤細胞系。Western-blotting實驗顯示NF_kB在敲減細胞中其表達量和活性均較亂序對照細胞為少(圖1)。
[0017]三、RIZl基因甲基化和表達的測定
[0018](I)RIZl基因甲基化的測定。DNA提自上述TOTC處理的和NF-kB敲減的腫瘤細胞系和它們的相應對照細胞。DNA先經亞硫酸氫鹽處理，然后進行PCR反應。對于未甲基化的 RIZl 基因，所用引物為:forward primer:5’ -TGGTGGTTATTGGGTGATGGT-3’，reverse primer:5’ -ACTATTTCACCAACCCCAAGA-3’。對于甲基化的 RIZl 基因，所用引物為 forward primer:5 ‘-GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC-3，， reverse primer:5 ‘-GCTATTTCGCCGACCCCGACG-3’。將上述反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。我們的結果顯示，在對照細胞中，所有RIZl基因均甲基化(圖2)。在TOTC處理和NF-kB基因敲減的腫瘤細胞中，部分RIZl基因去甲基化(圖2A)。
[0019](2)RIZ1基因表達的測定。
[0020]采用定量PCR的方法對RIZl基因表達進行測定。RNA提自上述TOTC處理的和NF-kB敲減的腫瘤細胞和它們的相應對照細胞。RNA進行逆轉錄反應以生成cDNA。隨后進行定量 PCR 檢測。對 RIZl 基因所用引物為:forward primer:5’-TCTGCTGTTGACAAGACCC-3’，reverse primer:5’ -GCATCAATGCACATCCATC-3’。對 GAPDH 基因(內參對照)所用引物為 -forward primer:5， -CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3，， reverse primer:5’ -TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。PCR結束后，根據標準品繪制標準曲線，從而計算出基因表達量。結果顯示，在I3DTC處理和NF-kB基因敲減的腫瘤細胞中，RIZl基因恢復表達(圖2B) ο
[0021 ]四、DNMTlmRNA 的測定
[0022]采用定量PCR的方法對DNMTl的表達進行測定。提取上述已構建的肝癌細胞系的RNA并進行逆轉錄反應以生成cDNA。隨后進行定量PCR檢測。對DNMTl基因所用引物為:forward primer:5，-AACCTTCACCTAGCCCCAG-3，，reverse primer:5’-CTCATCCGATTTGGCTCTTCA_3’。對GAPDH基因(內參對照)所用引物為:forward primer:5， -CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3，， reverse primer:5， -TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3，。 PCR 結束后，根據標準品繪制標準曲線，從而計算出基因表達量。結果顯示，在TOTC處理和NF-kB基因敲減的腫瘤細胞中，DNMTl表達下降(圖3)。
[0023]五、建立裸鼠皮下種植腫瘤模型
[0024]BALB/c-nu雌性裸鼠，隨機分成亂序對照組，NF_kB基因敲減組，和NF_kB合并RIZl雙基因敲減組。每只小鼠皮下注射0.2ml的相應的細胞PBS懸液，細胞濃度為2 X 17個/ml ο接種5天后開始測量腫瘤長度(a)和寬度(b)。腫瘤體積按公式aXb2/2計算。接種30天后處死裸鼠，稱取腫瘤重量。
[0025]實驗結果表明，抑制NF-kB活性，能夠有效的抑制RIZl基因的甲基化，從而恢復RIZl基因的表達，最終抑制人腫瘤細胞的增殖，其抑瘤率為84.9% (圖4)。當我們同時敲減RIZl基因時，這一抑制腫瘤作用明顯受損(圖4)。這一發現可為基因特異性治療腫瘤并應用于臨床提供理論與實踐基礎。
【主權項】
1.通過抑制NF-kB來治療存在有RIZl基因異常的腫瘤的應用，其特征在于，所述的腫瘤存在有RIZl基因的基因異常。2.根據權利要求1所述的應用，其中RIZl基因異常包括基因表達的缺失和下降。3.根據權利要求2所述的應用，其中RIZl基因表達的缺失和下降是由于DNA甲基化所致。4.根據權利要求1-3所述的應用，其中抑制NF-kB形式包括NF-kB基因沉默或NF_kB活性的抑制劑。5.根據權利要求4所述的應用，其中NF-kB基因沉默中為使用shRNA對基因進行敲減。6.根據權利要求5所述的應用，其中NF-kB基因沉默的特征為，所用shRNA的載體是逆轉錄病毒(含慢病毒)，腺病毒，腺相關病毒。7.根據權利要求4所述的應用，其中NF-kB活性的抑制劑為Pyrrolidinedith1carbamate。8.根據權利要求1所述的應用，其特征為，所述的腫瘤包括肝癌，肺癌，胃癌，結腸癌，乳腺癌，前列腺癌，腎癌，宮頸癌，食管癌，甲狀腺癌，卵巢癌，鼻咽癌，和白血病。
【專利摘要】本發明涉及NF-kB在治療RIZ1基因異常的腫瘤的應用。本發明首次提出NF-kB在腫瘤細胞中的異常活化導致RIZ1基因甲基化并使RIZ1基因的表達缺失或下降，針對NF-kB的特異性抑制或基因沉默是治療這些有RIZ1基因異常的腫瘤的新靶向。本發明為有針對性的治療腫瘤提供了一種新的應用手段。
【IPC分類】A61K48/00, A61P35/00, A61K31/7105
【公開號】CN105169412
【申請號】
【發明人】馮功, 韓立偉
【申請人】馮功, 韓立偉
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月25日