力學敏感的miR-138-5p作為藥物靶點在骨骼肌肉系統疾病中應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學及醫學領域，特別是設及一種力學敏感的miR-138-5p作 為藥物祀點在骨骼肌肉系統疾病中應用。
【背景技術】
[0002] MicroRNA(miRNAs)是一組進化保守的單鏈RNA分子，其鏈長較短（約22個核巧 酸），它能夠通過與祀基因3'非翻譯區結合從而抑制祀基因的翻譯或降解祀基因。到目前 為止，在人類細胞中，已鑒定出了 1424種microRNA，并且每一種microRNA都對大量祀基因 具有調節作用，人類大約50%的蛋白編碼基因是由microRNA調控的。MicroRNA參與復雜 的生物學過程，如早期發育、細胞增殖、細胞調亡、細胞死亡、脂肪代謝等，調控眾多的祀基 因器官，在生物體內分布廣泛。成骨細胞作為骨形成細胞在骨形成和發育過程中起到了重 要的作用。新近研究表明miRNAs通過調控成骨分化相關基因表達在骨形成中起關鍵作用。
[0003]文獻1 "B. Zuo, J. F. Zhu, J. Li, C. D. Wang, X. Y. Zhao, G.化Cai, Z. Li, J. P. Peng, Wang, C. Shen, Y. Huang, J. k. Xu, X. L. Zhang, X. D. Chen, microRNA-103a functions as a mechanosensitive microRNA to inhibit bone formation through targeting Runx2, Journal of Bone and Mineral Research. 30(2015)330-345."報道了miR-103a作 為一個對機械力敏感的microRNA,通過調節Runx2調節成骨細胞的分化W及骨形成。
[0004]miR-138作為一種microRNA,可通過精密調控其祀基因表達，參與細胞增殖、細 胞調亡、細胞分化等生物學過程。miR-138家族包括miR-138,miR-138-l，miR-138-2， miR-138-5p與miR-138-化等，miR-138-5p、miR-138-化依據其來源于pre-miR-138 的 5' 端臂或3'端臂而得名。近來研究發現，miR-138通過調節成骨相關信號通路，在成骨細胞 分化與骨形成中起關鍵作用。有數據庫證明miR-138和微管微絲交聯因子1 (micro化bule actincrosslinkingfactorLMACF1)有祀向作用，MACFl是一種新的細胞骨架交聯分子， 通過介導Axin蛋白復合物從胞漿向胞膜的轉運，參與Wnt/0 -catenin信號轉導。調節微 絲、微管骨架動力學，在力學響應、細胞信號轉導、細胞遷移等中均發揮重要作用。 陽0化]文獻2"T. Eskildsen, H. I'aipaleenmaki, J. Stenvang, B. M. Abdall址，N. Ditzel, A. Y. Nossent, M. Bak, S. Kauppinen, M. Kassem, MicroRNA-138regulates osteogenic differentiation of human stromal(mesenchymal)stem cells in vivo.Proc Natl Acad SciUS A. 108(2011)6139-6144."報道miR-138的表達隨著人骨髓間充質干細胞 分化而上調；利用miR-138的反義核巧酸antagomi;r-138體外轉染人骨髓間充質干細胞， 然后將細胞種植在徑基憐灰石材料制成的骨架上，再移植到N0D/SCID免疫缺陷小鼠中， 發現antagomi;r-138處理后，骨基質增加。進一步研究發現miR-138通過祀向FAK參與 FAK-E服1/2信號通路。
[0006] 上述方法證明了存在多種miRNAs對力學刺激比較敏感，且參與骨形成過程。但是 目前為止還沒有關于miR-138在去負荷運一力學刺激條件下對成骨細胞分化和骨形成的 作用的報道。
【發明內容】
[0007] 現有在骨組織研究中，關于miR-138-5P尚未見到祀向MCFl分子研究報道。文獻1 中miR-138-5p與miR-103a是完全不同的兩種microRNA，都對力學刺激敏感，但是二者祀分 子不同。相對于文獻2中提到的miR-138的成骨細胞分化過程中的作用，本發明主要說明去 負荷力學刺激導致miR-138-5p的升高，繼而利用其反義核巧酸緩解骨質疏松的應用。本發 明提供一種力學敏感的miR-138-5p作為藥物祀點在骨骼肌肉系統疾病中應用，且通過祀 分子MCFl參與骨形成。該發明利用S維回轉模擬力學去負荷條件培養的細胞，使細胞不 能感受到重力的作用。而在動物模型上，利用后肢去負荷小鼠模型。而且利用能夠攜帶小核 酸特異性勒!向遞送系統（AspSe;rSe;r) 6-liposome(ZhangG,etal,化t.Med. 2012)，通過尾 靜脈注射miR-138-5p的反義核巧酸antagomi;r-138-5p，將反義核巧酸特異性地輸送到骨 表面。重力也就是負荷力，是對骨的主要作用力上，去負荷會導致骨質疏松，本發明主要研 究去負荷力學刺激敏感的miR-138-5p，通過祀向MCFl參與骨形成過程，所WmiR-138-5p 可W作為治療骨骼肌肉疾病的藥物祀點。
[0008] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種力學敏感的miR-138-5p作為 藥物祀點在骨骼肌肉系統疾病中應用，其特點是采用W下步驟：
[0009] 步驟一、利用后肢去負荷小鼠動物模型，尾吊28天后，將主要承重骨股骨和腔骨 剝離，提取總RNA，在已有研究中查詢和骨形成有關的miRNAs，設計引物，利用qPCR技術檢 測尾懸吊小鼠模型中發生明顯改變的miRNAs。
[0010] 步驟二、利用qPCR和Western blot技術檢測去負荷條件下小鼠前成骨細胞 MC3T3-E1和承重骨中MCFl基因水平和蛋白水平表達的影響；
[0011] 步驟S、利用TargetScan數據庫分析miR-138與MACFl的祀向關系。
[0012] 步驟四、設計miR-138-5p的反義核巧酸，序列為
[0013] 5' -CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU-3'。體外轉染反義核巧酸到小鼠前成骨細胞 MC3T3-E1細胞中，利用礦化實驗、ALP染色實驗、W及qPCR技術檢測miR-138-5p的反義核 巧酸對成骨細胞的分化的影響。
[0014] 步驟五、利用qPCR技術檢測體外轉染miR-138-5p反義核巧酸對MCFl的影響。
[0015] 步驟六、利用S維回轉模擬體外去負荷條件，培養已經轉染miR-138-5p反義核 巧酸的小鼠前成骨細胞MC3T3-E1，之后利用qPCR技術檢測去負荷條件下，反義核巧酸 antagomi;r-138-5p對成骨細胞分化的影響。
[0016] 步驟屯、采用小鼠后肢力學去負荷模型，在尾懸吊前5天，利用能夠攜帶小核酸 特異性到達骨形成部位的祀向遞送系統（AspSerSe;r)6-liposome(ZhangG,etaLPfet. Med. 2012)，通過尾靜脈注射反義核巧酸antagomi;r-138-5p(lOmg/kg)，每兩天注射一次，連 續3次，然后尾懸吊28天。脫頸處死小鼠后，剝離取出相關的骨骼肌測量趾長伸肌、脾腸肌、 股四頭肌、比目魚肌、腔前肌相對重量變化，檢測antagomir-138-5p對骨骼肌的影響。
[0017] 步驟八、如步驟屯，脫頸處死小鼠后，剝離取出股骨，去除骨表面的軟組織，多聚甲 醒固定后，采用MicroCT掃描，用Microview V2. 1. 2分析測試骨相關參數，并進行=維重 建。剝離取出股骨腔骨，采用Reat time PCR檢測antagomi;r-138-5p對承重骨骨形成的影 響。
[0018] 本發明的有益效果是：本發明在后肢去負荷小鼠模型中，miR-138的表達明顯上 調。而且去負荷條件下，MCFl的mRNA和蛋白水平均下調。TargetScan數據庫也發現 miR-138-5p和MCFl有祀向作用。體外轉染反義核巧酸antagomir-138-5p前成骨細胞 MC3T3-E1的分化能力加強。而且miR-138-5p的反義核巧酸antagomi;r-138-5p能有效逆 轉去負荷對成骨細胞分化和承重骨骨形成的抑制作用。本發明所述的miR-138-5p的反義 核巧酸antagomir-138-5p通過調控MCF1，緩解去負荷對成骨細胞分化和骨形成的抑制作 用，可W作為治療骨質疏松或其他骨骼肌肉系統的藥物，對骨質疏松有潛在的預防和治療 價值。
[0019] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作詳細說明。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發明應用在小鼠后肢去負荷條件下發生明顯改變的miRNAs實驗結果圖。 V. S.Control,沖<0. 05, *沖<0. 01，**沖<0. 001。
[0021] 圖2是本發明應用S維回轉與后肢去負荷條件對MCFl表達的抑制效果圖。A，B: MCFl轉錄水平表達的相對表達量分析；C，D:Westernblot