與大麥抗白粉病相關的miR159a及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及作物分子生物學和分子育種領域，更具體地，涉及與大麥抗白粉病相 關的miR159a及其應用。
【背景技術】
[0002] 大麥是在全球廣泛種植的主要糧食作物之一，其世界播種面積僅次于小麥、水稻 和玉米，位列第四。大麥可做食品、飼料和啤酒釀制原料，具有重要的經濟價值。大麥白 粉病（barley powdery mildew)是大麥主要的真菌病害之一，由布氏白粉菌大麥專化型 (Blumeria graminis f.sp.hordei)引起。該病原真菌屬子囊菌綱白粉菌目，主要在宿主大 麥葉片表皮細胞內專性活體寄生，可侵害大麥植株的地上部各器官，但以葉片和葉鞘為主， 發病重時大麥莖桿和穗部也受侵害（J0rgensen, 1994, Crit. Rev. Plant Sci.)。大麥白粉 病多發生在潮濕和半潮濕地區，分布于世界各大麥產區。在歐洲各國、北美東部和南部地 區、日本等地，以及中國的貴州、四川和東南沿海等大麥種植區域均有普遍發生，一般可造 成20% -25%的產量損失，而在病害流行的年份里嚴重損失可達30%。近年來，由于大麥品 種單一化、高度密植和過量施用氮肥等栽培因素，使得大麥白粉病發病日趨嚴重。
[0003] 目前全球大麥白粉病的防治工作主要通過施用化學農藥完成。三唑類（triazole) 殺菌劑是有機雜環類化合物，是近四十年來針對麥類白粉病開發的廣譜、內吸、高效的化學 殺菌劑，適用范圍廣、使用方法靈活，對大麥白粉病的防治效果較好。三唑類殺菌劑的作用 機制是抑制病原真菌麥角留醇的生物合成，使菌體細胞膜結構和功能受到破壞，進而抑制 或干擾菌體附著胞及吸器的發育、以及菌絲和孢子的形成，降低病原真菌致病力。麥類作物 應用三唑類殺菌劑防治白粉病至今已有四十多年的歷史，白粉病菌對三唑類化合物已產生 抗性在國內外均有研究和報道。三唑類殺菌劑不僅有殺菌作用，還有植物生長調節作用，因 此在使用過程中常有藥害發生，影響作物的產量和品質。同時，大量使用化學殺菌劑會對環 境造成污染，并對人畜飲食安全和健康形成潛在的威脅。
[0004] 篩選、培育和種植抗病品種，是防治大麥白粉病的另一重要途徑，而發現和鑒定 大麥抗白粉病基因則是抗病育種工作中的重要一環。大麥對白粉病的抗性包括：一，依賴 小種專化抗性抗病基因（如MLA基因）產生的特異性抗性（Shen et al，2007, Science); 二，依賴非小種專化抗性抗病基因（如mlo基因）產生的廣譜抗性（Acevedo-Garcia et al，2014, New Phytol.);三，依賴非小種專化抗性抗病基因產生的部分抗性。通過傳統育種 方式和分子標記輔助篩選相結合，可以加速將大麥白粉病抗病基因向栽培品種中導入。
[0005] 大麥白粉病菌具有許多生理小種；主栽的大麥抗病品種的白粉病抗性往往與當地 的白粉菌優勢生理小種不同，因此不能產生有效的小種專化抗性。而且大麥白粉病菌變異 速度快，使得許多一時有效的小種專化抗性抗病基因在短時間內喪失抗性，成為選育和推 廣大麥抗病品種過程中育種工作者一直未能解決的難題。雖然運用mlo基因可以使大麥 對白粉菌產生高效的廣譜抗性，但是同時也會加速作物的細胞凋亡、降低作物對其他病害 的防御能力，最終影響作物產量，因此在抗性育種中的應用mlo基因也具有很大的局限性 (Acevedo-Garcia et al, 2014, New Phytol·)。近年來，基因沉默（RNA interference, RNAi) 技術在農作物防治病蟲害領域已經獲得了廣泛的應用（Koch and Kogel, 2014, Plant Biotechnol. J.)，但是過量表達的小RNA所負向調控的靶標基因大多來自有害生物（如病 毒、細菌、真菌、線蟲和昆蟲等）。
[0006] MicroRNA(miRNA)是一類長度一般約為21個核苷酸的小RNA分子，來源于一條 能夠形成莖環結構的單鏈RNA前體，并能通過堿基的互補配對靶向特異的靶標基因，對該 基因的表達進行負向調控。在植物中，miRNA不僅參與對植株生長發育的調控和對非生物 脅迫的耐受，也參與抵御外界病原菌侵染等生物脅迫過程。miRNA的表達量會在植物與病 原菌的相互作用中發生顯著變化，而miRNA合成缺陷突變體對病原菌入侵表現更為敏感， 說明miRNA在植物防御體系中是必要的功能元件，對植物抗病反應具有重要的調控作用 (Weiberg et al, 2014, Annu. Rev. Phytopathol.)。例如在擬南芥中，miR393 革巴向生長素信 號的重要受體TIR1、AFB2和AFB3,抑制生長素的信號傳遞過程，并增強植物對假單胞菌的 抗性（Navarro et al, 2006, Science)。近年來越來越多的證據表明，miRNA在多種作物針 對多種病原菌的抗病過程中起重要的調節作用。運用microRNA序列調控作物自身基因來 達到防治真菌病害目的的應用性研究尚鮮有報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種與大麥抗白粉病相關的miRNA。
[0008] 本發明的另一目的在于提供該miRNA在提高大麥抗白粉病抗性中的用途。
[0009] 本發明首先發現一種miRNA在白粉菌侵染大麥過程中的表達量發生明顯變化， 該miRNA命名為miR159a，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發明在接種白粉菌的大 麥葉片樣品中利用stem-loop real-time qPCR的方法檢測了 miR159a的表達豐度，發現 miR159a的表達量在大麥-白粉菌親和和非親和相互作用中均顯著升高。
[0010] 因此，本發明提供了與大麥抗白粉病相關的miRNA，其為miR159a，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0011] miR159a前體的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 本發明利用psRNATarget分析平臺預測了 miR159a在大麥中的革El標基因，發現一 個轉錄因子GAMYB基因可能是miR159a的靶標基因，然后通過煙草共表達實驗發現過表達 miR159a可以顯著降低GAMYB蛋白的積累水平，從而證明了 GAMYB的確為miR159a的靶標 基因，而且其表達受miR159a的負向調控。miR159a的靶標基因 GAMYB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示。
[0013] 含有本發明的與大麥抗白粉病相關的miR159a的表達載體也屬于本發明的保護 范圍。
[0014] 本發明利用基因槍法在大麥表皮細胞中瞬時過表達miR159a的靶標基因 GAMYB， 發現大麥細胞對白粉菌的抗性減低，在非親和相互作用中尤其顯著，表現為白粉菌的吸器 指數顯著升高，說明GAMYB基因是大麥抗白粉病的負調因子，而負向調控GAMYB基因表達的 miRl59a可以正向調控大麥對白粉病菌的抗性。
[0015] 進一步地，本發明提供了 miR159a或其表達促進劑或含有其的表達載體在負向調 控GAMYB基因中的應用。
[0016] 更進一步地，本發明提供了 miR159a或其表達促進劑或含有其的表達載體在提尚 大麥抗白粉病抗性中的應用。
[0017] 進一步地，本發明提供了 miR159a或其表達促進劑或含有其的表達載體在大麥種 質資源改良中的應用。
[0018] 本發明提供了 miR159a或其表達促進劑或含有其的表達載體在制備轉基因大麥 中的應用。
[0019] 本發明提供了用于克隆miR159a的PCR特異性引物對，上游引物如SEQ ID NO. 7 所示，下游引物如SEQ ID NO. 8所示。
[0020] 本發明提供了含有上述特異性引物對的試劑盒在篩選培育抗白粉病大麥中的應 用。
[0021] 本發明發現GAMYB基因是大麥抗白粉病的負調因子，其過表達能夠降低大麥抗白 粉病抗性。
[0022] 因此，本發明還提供了 GAMYB基因的過表達在降低大麥抗白粉病抗性中的應用。 所述GAMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示。
[0023] 本發明還提供了克隆GAMYB基因的特異性PCR引物對，其上下游引物的核苷酸序 列分別如SEQ ID NO. 5、6所示。
[0024] 本發明通過對miRNA表達譜的分析，發現miR159a在白粉菌侵染大麥過程中表達 量顯著上升，說明miR159a參與大麥防御白粉病菌侵染的過程并發揮生物學功能；本發明 通過在植物中同時過量表達miRl59a及其靶標基因 GAMYB，發現過量表達miRl59a可以明顯 抑制GAMYB蛋白的積累，說明miRl59a靶向GAMYB基因并負向調控其表達；通過在大麥表皮 細胞中瞬時過表達miR159a的靶標基因 GAMYB基因并接種白粉病菌，發現大麥對白粉病菌 的抗性明顯降低，說明miR159a可以增強大麥對白粉菌的抗性。本發明提供的miR159a可 廣泛應用于大麥遺傳育種、種質資源改良和培育抗白粉病的轉基因植物領域，對改進和改 良大麥等作物的種質資源具有重要作用。
【附圖說明】
[0025] 圖1為白粉菌侵染對大麥miR159a表達水平的影響圖。
[0026] 圖2為miR159a與GAMYB中靶標位點堿基序列的互補情況圖，圖中顯示了 miR159a 核苷酸序列和GAMYB基因轉錄產物mRNA序列中miR159a靶向位點的堿基互補情況。其中， 堿基完全互補以豎杠標示。
[0027] 圖3為用于在煙草中過表達miR159a和GAMYB基因的載體區段示意圖。圖中顯示 了在煙草中過表達miR159a和GAMYB基因所用的載體中相應的表達框架。其中，HA標簽融 合到GAMYB蛋白的C末端，用于通過蛋白印跡法監測GAMYB蛋白的積累量；圖中箭頭標示出 GAMYB基因中被miR159a靶向的位點。
[0028] 圖4為在煙草中過表達miR159a抑制GAMYB蛋白的積累的效果圖。實驗處理中含 有該過表達載體時以" + "號標示，不含有該