過表達載體時以號標示。利用HA標簽的抗 體，通過蛋白印跡法檢測出HA的積累量代表了其融合蛋白GAMYB的積累量，而麗春紅染料 (定量蛋白質上樣量染料）染色顯示了不同實驗處理的蛋白樣品上樣量均勻一致。在檢測 miR159a表達量的實驗中，對作為內參的肌動蛋白的表達量的檢測顯示了不同實驗處理中 所用核糖核酸量均勻一致。
[0029] 圖5為大麥表皮細胞中過表達miR159a的靶標基因 GAMYB對大麥白粉病菌抗性的 影響。白粉菌吸器指數代表了大麥表皮轉化細胞的感病性，數值越高說明大麥表皮細胞越 感病。用毒性白粉菌小種A6(圖5左圖）和無毒白粉菌小種Kl (圖5右圖）接種瞬時過表 達了空載體或GAMYB基因的、遺傳背景中含有MLAl基因的大麥品種POl的葉片后，可以看 出過表達miR159a的靶標基因 GAMYB可導致大麥細胞對白粉菌的本底抗性（圖5左圖）和 小種專化抗性（圖5右圖）均有所下降。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0031] 若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技 術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中使用的大麥品種均為P01，記載在 Shen et al，2007, Science中，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所（以下簡稱 為"中科院遺傳所"）獲得；大麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp.hordei)生理小種Kl和 A6記載在Shen et al，2003, Plant Cell中，公眾可從中科院遺傳所獲得；CTAP載體記載 在Bai et al，2012，PLoS Pathog.中，公眾可從中科院遺傳所獲得；pKANNIBAL載體記載在 Liu et al, 2014, PLoS Genet.中，公眾可從中科院遺傳所獲得；pUbi載體記載在Shen et al，2003, Plant Cell中，公眾可從中科院遺傳所獲得。
[0032] 實施例1 miR159a在大麥白粉菌侵染大麥過程中的表達譜分析
[0033] (1)植物材料的準備。大麥品種POl種子播種后，待長至1周左右，剪下旗葉，葉面 朝上，放置于含有培養基（1 %瓊脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培養皿上，恢復24小時后分別接 種大麥白粉病菌生理小種Kl或A6,并分別在接種后不同時間點取葉片材料。
[0034] (2)植物總RNA的提取。在液氮中迅速研磨300mg大麥葉片至粉末狀，加入 Iml TRizol，充分震蕩混勾后于4°C 12, OOOrpm離心10min;上清轉移到新離心管中，加入 l/5TRizol體積的氯仿，混勾后室溫靜置3min等待其分層，之后于4°C 12, OOOg離心15min。 上清轉移到新離心管中，先加入上清體積10%的3M醋酸鈉 （pH 5. 2)，混勻后再加入上清體 積1倍的異丙醇，混勻后于_20°C中靜置60min。4°C 10, OOOg離心15min，棄上清，用75% 乙醇洗滌沉淀兩次，每次室溫靜置lOmin，之后4°C 7500rpm離心5min，沉淀在室溫下晾置 10min。用60 μ I DEPC水溶解沉淀，獲得的植物總RNA。
[0035] (3) Stem-loop real-time qPCR 的反轉錄反應。
[0036] 反應所需的引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCA GAGCT-3' 〇 (SEQ ID NO. 4)
[0037] 反轉錄體系為：dNTP 1 μ 1，50nM stem-loop RT primer 1 μ 1，加 DEPC H2O 至 10 μ 1，65 °C 變性 5min，冰上冷卻 2min ;之后加入 10XM-MLV buffer 2 μ 1，RNase inhibitor 0.5 μ 1，M-MLV 1 μ 1，總 RNA 2 μ g，加 DEPC H2O 至 20 μ 1。反轉錄條件為： 16°C 30min，42°C 30min，85°C 5min。
[0038] (3) Stem-loop real-time qPCR 的其他實驗方法參考文獻 Chen et al，2007, Nucleic Acids Res.。按照以下體系配置熒光定量PCR反應液：2XqPCR Mix 5μ1，100χ CXR 0· 1以1，10 4]\1正向引物0.2 4 1，1(^]\1反向引物0.2 4 1，加(1(1!120至1(^1。 接著，將上述反應液以8 μ 1/管分裝到qPCR專用小管中，每管分別加入2 μ 1待測模板cDNA 混勻，離心使反應液聚集在管底，蓋膜。然后，按照以下程序在ABI熒光定量PCR儀上進行反 應：95°C 10min，95°C 15sec，60°C lmin，40 個循環。設置溶解曲線：95°C 10sec，65°C lmin， 0. 2°C階梯升溫，讀熒光值，升溫至95°C結束。檢測miR159a表達量所需的qPCR引物如下：
[0039] 正向：5,-CGGCGGTTTGGATTGAAGGGA-3，；（SEQ ID NO. 9)
[0040] 反向：5,-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，；（SEQ ID NO. 10)
[0041] 用毒性白粉菌小種A6和無毒白粉菌小種Kl接種遺傳背景含有MLAl基因的大麥 品種P01，在接種0、4、16、22和48小時后采集葉片樣品，并檢測葉片組織中miR159a的相對 表達量，進而研究白粉菌侵染對大麥miR159a表達水平的影響。用Stem-loop real-time qPCR方法可以檢測出這些葉片樣品中miR159a的相對表達量。實驗結果見圖1，用毒性白 粉菌小種A6接種大麥品種POl可以反映出大麥對白粉菌的本底抗性，而用無毒白粉菌小種 Kl接種大麥品種POl可以反映出大麥對白粉菌的小種專化抗性。結果表明，無論是在接種 毒性白粉菌小種后的本底抗性中，還是在接種無毒白粉菌小種后的小種專化抗性中，大麥 細胞中miR159a的表達豐度都隨時間變化有顯著上升，說明miR159a參與大麥對白粉病菌 的抗性過程并發揮相應的生物學功能。miR159a的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其前體 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0042] 實施例2對miR159a靶標基因 GAMYB基因的預測及克隆
[0043] (I)miRNA革巴標基因預測。
[0044] 對miR159a靶標基因的預測在psRNATarget網站上在線完成，參數設置為默認。 (psRNATarget 網站地址：http://plantgrn. noble. org/psRNATarget/)發現轉錄因子 GAMYB基因可能為miR159a的靶標基因（見圖2)。
[0045] (2)GAMYB基因的克隆。大麥品種POl的7天幼苗接種大麥白粉菌生理小種K1，24 小時后取葉片材料，提取RNA后進行反轉錄獲得cDNA。反轉錄體系和過程如下：RNA 2 μ g， 01ig〇-dT 1 μ 1，加 DEPC-H2O至12 μ 1，離心管混合上述溶液后于70°C變性10分鐘，再于 冰上冷卻2分鐘，之后在離心管中繼續加入M-MLV Buffer 2 μ l，dNTP mix 1 μ 1，RNase inhibitorO. 5 μ 1，M-MLV I μ 1，加 DEPC-H2O 至 20 μ 1，于 42°C溫浴 I 小時，70°C保溫 15 分 鐘后獲得反轉錄的cDNA。
[0046] 克隆GAMYB基因的PCR擴增所需的引物如下：
[0047] 正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0048] 反向：5,-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3,（SEQ ID NO. 6)。
[0049] PCR 反應體系為：KOD buffer 5yl，MgS042 yl，dNTP 5yl，cDNA 2μ1，正、反向引 物各 1μ1，Κ(? plus酶 1以1，加氏0 至50μ1。PCR 反應程序為：94°C 3min+(94°C 30s+58°C 30s+68°C 90s) X30 個循環 +68°C 10min。
[0050] 反應得到1662bp的PCR產物，將該PCR產物測序，結果為序列表中序列3所示的 核苷酸序列，該序列所示的基因命名為GAMYB ;該基因編碼的蛋白命名為GAMYB，該蛋白的 氨基酸序列為序列表中的序列15。
[0051] 實施例3對miR159a靶向GAMYB基因并負向調控其表達的驗證
[0052] (1)將miR159a及其靶標基因 GAMYB分別克隆到表達載體pKANNIBAL和CTAP中。
[0053] 克隆miR159a的PCR擴增所需的引物如下：
[0054] 正向：5'-GTTCCTCGAGCCGTTCCATATCTTCTAGCCCC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0055] 反向：5,-CCTCAAGCTTTTGAGGGGAAAACAAAACACCG-3,（SEQ ID NO. 8)。
[0056] 克隆GAMYB基因的PCR擴增所需的引物如下：
[0057] 正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3'（SEQ ID NO. 5);
[0058] 反向：5'-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0059] 在煙草中過表達miR159a和GAMYB基因所用的載體中相應的表達框架見圖3。
[0060] (2)農桿菌的轉化。將農桿菌菌株GV3101在LB固體培養基上劃線培養，兩日后挑 取單菌落，在LB培液基中180rpm 28°C過夜培養。過夜培養物擴大培養至0D_為0. 5后， 將菌液置于冰上30分鐘，4°C 3000rpm離心1