5分鐘后收集菌體，用IOml 0. 15M的預冷NaCl 溶液重懸菌體，4°C 5000rpm離心10分鐘后再次收集菌體。用Iml預冷的20mM CaCl2溶液 重懸菌體，加入0. 5mL 50 %甘油，充分混勻獲得農桿菌感受態細胞。在農桿菌感受態細胞中 加入表達載體DNA，輕輕吹打混勻，置于冰上30分鐘后用液氮速凍1分鐘，然后用37°C水浴 熱激3分鐘。加入1ml LB培養液28°C 180rpm培養30分鐘，涂布于加有相應抗生素的LB 固體培養基上，28°C倒置培養2天后挑選克隆，保存農桿菌轉化體。
[0061] (3)用農桿菌介導miR159a及其靶向GAMYB基因在煙草葉片中瞬時共表達。將轉 化相應表達載體的農桿菌菌株在LB固體培養基上劃線，兩日后挑取農桿菌單菌落，在LB培 養液中230rpm 28°C培養過夜。過夜培養物按1:50轉接到8ml LB培養液（含IOmM MES及 0. 02mM乙酰丁香酮）中，繼代培養至OD6。。為1. 5后3000rpm離心15分鐘收集菌體，重懸菌 體至0D6。。為0· 7,24°C避光靜置4小時后注射4周大小的煙草（Nicotiana benthamiana) 葉片。在煙草葉片中注射轉化了 miR159a表達載體的農桿菌菌株后保濕培養24h，在注射原 位置再次注射轉化了 GAMYB基因表達載體的農桿菌菌株，培養48h后取注射位置的葉片組 織，提取總RNA及總蛋白。
[0062] (4)miR159a表達量分析及GAMYB蛋白積累量分析。對提取的煙草葉片總RNA進 行反轉錄獲得cDNA，按照RT-PCR反應體系和條件在不同的循環數下擴增樣品的內參基因 Actin (肌動蛋白基因）。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過DNA條帶亮度檢驗模板量是 否一致；若不一致，將產物亮度較高的模板進行一定倍數的稀釋，直至產物亮度基本一致。 此時，通過RT-PCR反應檢測miR159a的表達量（圖4)。利用抗HA多克隆抗體，通過蛋白印 跡法檢測出煙草葉片總蛋白中GAMYB蛋白的積累量（圖4)，通過相應的表達載體，利用農桿 菌介導miR159a和GAMYB蛋白在煙草中瞬時共表達，并以空載體和GAMYB的瞬時共表達作 為負對照，研究過表達miR159a對GAMYB蛋白積累的影響。
[0063] 檢測miR159a表達量所需的qPCR引物如下：
[0064] 正向：5'-CGGCGGTTTGGATTGAAGGGA-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0065] 反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0066] 內參 ACTINl (肌動蛋白）正向：5'-TGGCACCCGAGGAGCACC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0067] 內參 ACTINl (肌動蛋白）反向：5'-GTAACCTCTCTCGGTGAG-3'。（SEQ ID NO. 12)
[0068] 實驗結果表明，在煙草中通過共注農桿菌法過表達miR159a后，可以顯著抑制 GAMYB蛋白的積累（圖4)，說明miR159a確實靶向GAMYB基因并負向調控其蛋白積累量。 由于miR159a負向調控GAMYB基因的表達量，miR159a在大麥對白粉病抗性中的作用，與 GAMYB基因在大麥對白粉病抗性中的作用相反。當共表達空載體和GAMYB時，GAMYB蛋白有 一定數量的積累，而共表達miR159a和GAMYB時，已經檢測不到GAMYB蛋白的積累，說明在 煙草中過表達miR159a可抑制GAMYB蛋白的積累。
[0069] 實施例4大麥表皮細胞中過表達miR159a靶標基因 GAMYB對大麥白粉病菌抗性的 研究
[0070] (1)將miR159a靶標基因 GAMYB克隆到克隆載體pENTRY中，并進一步通過LR反應 將該基因整合到表達載體CTAP中。
[0071] 克隆GAMYB基因所需的引物如下：
[0072] 正向：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTACC
[0073] GGGTGAAGAGCGAG-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0074] 反向：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTTGAATT
[0075] CCTCCGACATTTGAC-3'。（SEQ ID NO. 14)
[0076] (2)基因槍介導的大麥單細胞基因瞬時過表達。取9mg金粉，在65°C烘干4h后加 入Iml 70%乙醇，震蕩清洗5min，靜置15min沉降，離心2秒后棄上清。加入1ml滅菌去離 子水后震蕩2min，放置Imin后離心2秒，棄上清。重復2次后加入1ml 50%甘油，震蕩混 勻。將準備好的金粉震蕩5min后，將質粒DNA與GUS報告基因表達質粒等摩爾混合，加去 離子水至5 μ 1 ;在50 μ 1金粉中加入質粒DNA混合物，在震蕩的同時逐滴加入50 μ I 2. 5M CaCl2，然后快速加入20 μ 1 0.1 M亞精胺，繼續震蕩3min。靜置Imin沉降，離心2秒后棄上 清，分別用140 μ 1 70%乙醇和140 μ 1 100%乙醇洗滌，之后加入12 μ 1 100%乙醇后震蕩 混勻。
[0077] 使用型號為FOS-lOOO/He delivery system(Bio-Rad)的基因槍進行轟擊。將載 體膜放到載體膜支撐盤中，將金粉均勻涂抹在載體膜中央后涼干；將爆破膜片放置到爆破 膜片夾盤，固定在加速器上；將載體膜支撐盤加上阻擋網，放置到轟擊室第一層，并將載有 葉片的平板放在第三層后抽真空，待真空值達到27英寸汞柱后發射轟擊。轟擊后將葉片在 培養皿上擺好，放入人工氣候箱靜置培養。
[0078] (3)接種白粉菌及吸器指數統計。接菌時取帶有成熟白粉菌孢子的大麥植株在接 受過基因槍轟擊的葉片上方輕輕抖動，使孢子均勻下落；靜置3min后封好培養皿，放入人 工氣候箱靜置培養。將培養48h的大麥離體葉片浸在GUS染色液中染色，抽真空3次、每次 5min，期間輕輕顛倒；37°C溫育過夜，之后將葉片浸在脫色液中室溫脫色兩天。將葉片在清 水中清洗lh，在考馬斯亮藍溶液中染色10秒，用水清洗2次；葉片正面朝上放置到載玻片 上，滴50%甘油，壓上蓋玻片，在顯微鏡下觀察。分別統計感病（含有吸器和次級菌絲）和 抗病（只有附著胞）的、表達GUS的細胞數目，感病細胞數目與統計細胞數目總和的比值即 為吸器指數。
[0079] 本實驗利用基因槍介導在大麥表皮單細胞中瞬時過表達miR159a的靶標基因 GAMYB，以瞬時過表達空載體為負對照，結合之后的白粉菌接種和吸器指數統計，研究了在 大麥表皮細胞中過表達miR159a的靶標基因 GAMYB對大麥白粉病菌抗性的影響。實驗結果 表明，在大麥表皮單細胞中用基因槍轟擊法過表達miRl59a的靶標基因 GAMYB后，大麥細胞 對白粉菌的本底抗性有所下降，表現為在接種毒性白粉菌小種后吸器指數較對照有所上升 (圖5左圖），而大麥細胞對白粉菌的小種專化抗性明顯下降，表現為接種無毒白粉菌小種 后吸器指數較對照明顯上升（圖5右圖），說明GAMYB基因是大麥抗白粉病的負調因子，進 一步說明miR159a可以正向調節大麥細胞對白粉菌的抗病性。
[0080] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 與大麥抗白粉病相關的miRNA，其為miR159a，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 如權利要求1所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA，其前體的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。3. 如權利要求1所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA，其特征在于，其靶標基因為 GAMYB基因，GAMYB基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。4. 含有權利要求1-3任一所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA的表達載體。5. 如權利要求1-3任一所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA或其表達促進劑或權利要 求4所示的表達載體在負向調控GAMYB基因中的應用。6. 如權利要求1-3任一所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA或其表達促進劑或權利要 求4所;^的表達載體在提尚大麥抗白粉病抗性中的應用。7. 如權利要求1-3任一所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA或其表達促進劑或權利要 求4所示的表達載體在大麥種質資源改良中的應用。8. 如權利要求1-3任一所述的與大麥抗白粉病相關的miRNA或其表達促進劑或權利要 求4所示的表達載體在制備轉基因大麥中的應用。9. 用于克隆miR159a的PCR特異性引物對，其特征在于，上游引物如SEQIDNO. 7所 示，下游引物如SEQIDNO. 8所示。10. 含有權利要求9所示的特異性引物對的試劑盒在篩選培育抗白粉病大麥中的應 用。
【專利摘要】本發明提供了與大麥抗白粉病相關的miR159a及其應用，屬于基因工程領域與作物分子生物學領域。本發明的miR159a來源于大麥，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，其靶標基因是GAMYB，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示。本發明發現在大麥表皮細胞中瞬時過表達能夠使大麥細胞對白粉菌的抗性減低，本發明還發現GAMYB基因的表達受miR159a的負向調控，負向調控GAMYB基因表達的miR159a可以正向調控大麥對白粉病菌的抗性。本發明提供的與大麥抗白粉病相關的miR159a可用于大麥種質資源的改良及遺傳育種領域，還可用于培育抗白粉病的大麥品種，具有良好的市場應用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/11
【公開號】CN105177002
【申請號】
【發明人】劉杰, 沈前華, 谷成, 程溪柳
【申請人】中國科學院遺傳與發育生物學研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月15日