超高效液相色譜串聯質譜檢測血清25羥基維生素d的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及維生素 D檢測的技術領域，特別設及一種超高效液相色譜串聯質譜檢 測血清25徑基維生素 D的方法。
【背景技術】
[0002] 維生素 D為脂溶性非必需維生素，是固醇類衍生物，25徑基維生素 D是維生素 D在肝 微粒體25徑化酶的作用下轉化形成，由于其與維生素 D的其他代謝產物相比，在血液中的濃 度高且循環周期長，而成為維生素 D體內濃度的良好指示劑，是人體維生素 D營養狀況的評 價指標。
[0003] 維生素 D家族成員中最重要的是維生素化和維生素化。維生素化多含于植物性食物 中，它是植物的麥角固醇經陽光照射而合成。維生素化占人體總量90%-95 %，主要是由皮 膚內的7-脫氨膽固醇在特定波長的紫外線照射作用下合成，也可通過食物攝取獲得。維生 素 D具有調節人體血清巧憐代謝，維持骨骼和肌肉的正常生理作用。隨著對于維生素 D的深 入研究發現，人群中維生素 D缺乏普遍存在，且維生素 D缺乏與各類疾病的發生和發展密切 相關，比如肥胖、高血壓、糖尿病、屯、梗等屯、血管疾病和代謝綜合征疾病。因此維生素 D缺乏 與各類疾病的相互關系引起國內外研究機構的廣泛關注。
[0004] 傳統的25徑基維生素 D檢測方法有放射免疫分析法、酶聯免疫法、化學發光法、電 化學發光法和高效液相色譜法等。但主要存在如下問題:第一，由于25徑基維生素 D在人體 內主要與血清結合蛋白結合，人體內存在大量的高親和力結合蛋白，因此檢測存在嚴重的 基質干擾。而傳統的放射免疫法和發光法，不能有效去除基質干擾;第二，現有檢測技術前 處理過程復雜、方法特異性差;第=，免疫法有時存在交叉反應，出現假陽性結果，同時發光 法存在發光效率低等問題。因此免疫法和發光法不能同時準確定量25徑基維生素化和25徑 基維生素化的含量，無法給出準確的25徑基維生素 D的總含量;第四，上述傳統方法整個檢 測過程時間長、通量低。
[000引因此，需要分析領域技術人員迫切解決的一個問題就是：如何提供一種適合用于 人體血清的25徑基維生素 D的檢測方法。相比傳統免疫法和液相色譜法，液相色譜串聯質譜 法(LC-MS/MS)能夠解決上述問題，目前國際普遍認為LC-MS/MS是檢測血清中25徑基維生素 D的"金標準"。然而該"金標準"處理過程復雜，靈敏度和精密度有待進一步提高。
【發明內容】
[0006] 本發明旨在解決現有技術的不足，提供一種適用于人體血清的25徑基維生素 D的 檢測方法，能夠有效去除基質干擾，快速檢測。
[0007] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[000引超高效液相色譜串聯質譜檢測血清25徑基維生素 D的方法包括如下步驟：
[0009] (1)向血清樣品中加入體積為血清樣品體積1/15至2/15的25徑基維生素 D的內標 物，加入硫酸鋒溶液和甲醇溶液進行蛋白質沉淀;充分混勻后加入正己燒溶劑萃取;再充分 混勻后離屯、，得到上清液和沉淀，移取上清液后用氮氣吹干沉淀，再加入復溶液，得到待測 樣品；所述25徑基維生素 D內標物包含6d-25H基維生素化和/或6d-25H基維生素 D3;所述復 溶液為甲醇和水按7: (2-4)，優選7:3的體積比混合的混合液；
[0010] 其中，所述血清樣品、硫酸鋒溶液、甲醇溶液、正己燒溶劑的體積比為1 :(0.8- 1.2) : (1.8-2.2): (4-6)，優選1:1: 2 : 5 ;所述復溶液與血清樣品的體積比為1: (1.8- 2.2) ，優選 1:2;
[0011] (2)對待測樣品用超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測。
[0012] 優選地，步驟(2)所述質譜采用正離子模式，并采用多反應監測離子掃描MRM的掃 描方式；
[0013] 所述正離子模式中，內標定量離子對包括6(1-25徑基維生素化定量離子對和6d-25 徑基維生素化定量離子對；目標定量離子對包括25徑基維生素化定量離子對和25徑基維生 素化定量離子對；目標定性離子對包括25徑基維生素化定性離子對和25徑基維生素化定性 離子對；
[0014] 內標定量離子對的多反應監測離子掃描MRM的質荷比條件為：
[0015] 64-25?基維生素化定量離子對的母離子的質荷比為419.3,對應的子離子的質荷 比為83.1;
[0016] 64-25?基維生素化定量離子對的母離子的質荷比為407.3,對應的子離子的質荷 比為159.1;
[0017] 目標定量離子和目標定性離子的多反應監測離子掃描MRM的質荷比條件為：
[0018] 25徑基維生素化的母離子的質荷比為413.35,對應的定量離子的質荷比為395.3， 定性離子的質荷比為83.1;
[0019] 25徑基維生素化的母離子的質荷比為401.35，對應的定量離子的質荷比為383.3， 定性離子的質荷比為159.1;
[0020] 所述液相色譜采用梯度洗脫模式，液相色譜條件為：
[00引]色譜柱:AC卵口Y UPLC 邸H C18 Column(2.1 X 50臟，1.7皿）；
[0022] 色譜柱柱溫:45。0;
[0023] 進樣量:20ul;
[0024] 流速:〇.4ml/min;
[0025] 流動相：流動相A為含2mM乙酸錠和0.1 %甲酸的水，流動相B為含2mM乙酸錠和 0.1%甲酸的甲醇；
[0026] 6(1-25?基維生素 D3和25徑基維生素 D3的保留時間為3.09min，6d-25^基維生素化 和25徑基維生素化的保留時間為3.16min;
[0027] (3) W化徑基維生素化和25徑基維生素化的保留時間為定性依據，判斷25徑基維生 素化和化徑基維生素化的存在；
[0028] 依據25徑基維生素化和25徑基維生素化與對應內標物在內標標準曲線上的峰面積 比值，計算血清樣品中的25徑基維生素化和化徑基維生素化的含量。
[0029] 另外，所述反應監測離子掃描MRM的錐孔電壓、駐留時間、碰撞能量條件如下：
[0030] 物質 離子對 錐化電化(V) 駐留時間巧）碰撞能量（V) 250HD： 413.35>3953* 24 0.05 10 250HD: 413,35>83.1 .24 0.05 22 250HD] 401.一巧 >383.3* 24： 0.05 10 250HD; 401.35> 159.1 24 0.05 28 C16-250HD2 419,35>83.1 24 0.05 2玄 C16-250HD3 407.35> 159.1 24. 0.05 28
[0031] 其中，*代表定量離子對
[0032] 所述梯度洗脫的條件如下： 時間（單位min) A流動相比例（％) B流動相比例（％) 0.00 11 巧 2胤） 巧 巧
[0033] 3.50 2 魄 3.51 27 73 6.00 27 73
[0034] 所述質譜中質譜離子源參數如下：
[003引電離源：電噴霧電離ESI源；
[0036] 脫溶劑氣溫度:400°C;
[0037] 脫溶劑氣流速:900L/化；
[003引離子源溫度：120°C;
[0039] 毛細管電壓:2500V。
[0040] 優選地，步驟（1)中所述離屯、的條件為：在室溫下，W 13000r/min的速度離屯、5-lOmin。步驟(1)所述用氮氣吹干沉淀是通入45-55°C的氮氣直至沉淀干燥。
[0041] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0042] 本發明應用超高效液相色譜串聯質譜儀進行檢測，本發明可W同時定性或定量檢 測出人血清中的25徑基維生素化和化徑基維生素化；
[0043] 本發明通過硫酸鋒溶液聯合甲醇溶液進行蛋白質沉淀，通過正己燒液液萃取，氮 氣吹干復溶后便可W用超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測；
[0044] 本發明前處理簡單，并且可W有效去除基質干擾，特異性、抗基質干擾能力強；
[0045] 本發明應用超高效液相色譜串聯質譜儀進行檢測，檢測時間短，通量高，檢測靈敏 度、精密度高，成本低廉。
[0046] 總之，本發明采用蛋白質沉淀和液液萃取法得到25徑基維生素 D提取液，利用超高 效液相色譜串聯質譜儀進行檢測，同位素稀釋法定量。滿足前處理簡單，能有效去除基質干 擾，同時準確定量檢測25徑基維生素化和25徑基維生素化，并且整個檢測過程時間短，通量 高。相比目前已報道的LC-MS/MS法檢測25徑基維生素 D的文獻，本發明前處理更簡單，不需 要進行固相萃取凈化操作或者在線固