化的含量之和作為25徑基維 生素 D的含量。
[0107] 基于上述的實驗條件，經過多次試驗驗證，本發明實施低、中、高濃度加標回收實 驗的日內精密度和連續3天的日間精密度的RSD<9%。25徑基維生素化和25徑基維生素化的 檢出限（S/N=3)分別為0.：3ng/ml和0.化g/ml，25^基維生素化和25徑基維生素 D3的定量限 (S/N= 10)分別為0.8ng/m巧日0.5ng/ml (參見圖I)。簡單有效的前處理過程，高分辨率和高 靈敏度的液相色譜串聯質譜儀，適宜的液相條件和良好的質譜參數的優化，使得本發明的 實施數據優于已報道的文獻數據。
[0108] 實施例2為使本領域技術人員更好地理解本發明，現提供一個例子來說明本發明 用于25徑基維生素 D的檢測方法的具體實現過程。
[0109] 將150ul人血清移取至潔凈的2ml離屯、管中，加入IOul內標溶液，混勻10s，加入 0.2M硫酸鋒溶液150ul，混勻IOs，加入300ul甲醇，混勻IOs，加入750ul正己燒，混勻30s，離 屯、（13000巧m，5min)，取上清液600ul，50°C氮氣吹干，最后用75ul 70 %甲醇水溶液復溶，滿 旋混勻后，轉移至玻璃內襯管，加載至液相色譜自動進樣器中。
[0110] 液相色譜自動進樣器自動將樣品加載到色譜柱，然后通過流動相傳遞至質譜儀 LC-MS/MS"LC-MS/MS采用電噴霧電離源化SI)串聯四級桿質量分析器作為質譜檢測器進行 分析。其中，脫溶劑氣溫度為400°C，脫溶劑氣流速為90化/化，離子源溫度為120°C，毛細管 電壓為2500V。采用多反應監測離子MRM掃描，其條件參見表1。
[0111] 表1反應監測離子掃描MRM條件
[0114] 其中，*代表定量離子對
[0115] 自動進樣器自動將20ul預先凈化好的樣品加載到超高效液相色譜系統中，液相色 譜條件參見表2。色譜柱采用AC卵口Y UPLC邸H C18 Column(2.1 X 5〇111111，1.7皿），4流動相 為含2mM乙酸錠和0.1 %甲酸的水，B流動相為含2mM乙酸錠和0.1 %甲酸的甲醇，其中，色譜 柱柱溫為45°C，進樣量為20ul，流速為0.4ml/min。
[0116] 表2液相色譜條件
[0118]樣品隨流動相排出色譜柱出口后，在壓力的作用下進入質譜儀離子源或廢液，由 六通閥控制進入離子源的樣品通道。在離子源內液體樣品被汽化并且電離為帶電離子，帶 電離子在電壓和真空作用下，進入Q1、Q2和Q3,其中，Ql和Q3為質量分析器，只允許根據25徑 基維生素化和25?基維生素化的質荷比選擇的母離子和子離子通過，Q2為碰撞單元，母離子 在此處與惰性氣體原子碰撞，產生特定的碎片離子。
[0119] 質譜儀的第一個四級桿(Ql)選擇具有25徑基維生素化、25徑基維生素化、6(1-25徑 基維生素化和 6(1-25徑基維生素化（內標)的特定質荷比mA的離子，具有運些m/z比的離子被 允許進入Q2，Q2產生的碎片離子進入到Q3,其中只有25徑基維生素化、25徑基維生素化和內 標的碎片離子被選擇通過，而其他離子被除去。參見表3,出示了被用于鑒別和定量的25徑 基維生素 D。
[0120] 表3 25徑基維生素 D的質量轉變表
[0122] 隨著離子與檢測器碰撞，它們將捕獲到的離子質量數轉化成數字信號的電子脈 沖。所獲得的數據被傳遞到計算機，其將所收集的離子信號強度對時間作圖，即得質譜總離 子流圖。
[0123] 血清標準物中分析物和內標的峰面積的比值被用于構建內標標準曲線，然后該曲 線被用于計算樣品或質量控制物中分析物濃度，結果見表4;
[0124] 表4 25徑基維生素化和化徑基維生素化的精密度
[0126]某權威檢測中屯、，采用本實施方法進行了 1000例的人體血清250皿檢測，檢測結果 顯示質量控制物質結果準確，實驗人員每日至少可W檢測100份樣品，檢測效率高。說明本 方法準確可靠，前處理簡單，分析時間短。
【主權項】
1. 超高效液相色譜串聯質譜檢測血清25羥基維生素 D的方法，其特征在于，所述方法包 括如下步驟： (1) 向血清樣品中加入體積為血清樣品體積1/15至2/15的25羥基維生素 D的內標物，加 入硫酸鋅溶液和甲醇溶液進行蛋白質沉淀;充分混勻后加入正己烷溶劑萃取;再充分混勻 后離心，得到上清液和沉淀，移取上清液后用氮氣吹干沉淀，再加入復溶液，得到待測樣品； 所述25羥基維生素 D內標物包含6d-25羥基維生素02和/或6d-25羥基維生素 D3;所述復溶液 為甲醇和水按7: (2-4)的體積比混合的混合液； 其中，所述血清樣品、硫酸鋅溶液、甲醇溶液、正己烷溶劑的體積比為1:(0.8-1.2): (1.8-2.2): (4-6);所述復溶液與血清樣品的體積比為I: (1.8-2.2); (2) 對待測樣品用超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述質譜采用正離子模式，并采用多 反應監測離子掃描MRM的掃描方式； 所述正離子模式中，內標定量離子對包括6d_25羥基維生素 D2定量離子對和/或6d-25羥 基維生素 D3定量離子對；目標定量離子對包括25羥基維生素 D2定量離子對和/或25羥基維生 素 D3定量離子對；目標定性離子對包括25羥基維生素 D2定性離子對和/或25羥基維生素 D3定 性咼子對； 內標定量離子對的多反應監測離子掃描MRM的質荷比條件為： 6d-25羥基維生素 D2定量離子對的母離子的質荷比為419.3,對應的子離子的質荷比為 83.1； 6d-25羥基維生素 D3定量離子對的母離子的質荷比為407.3,對應的子離子的質荷比為 159.1； 目標定量離子和目標定性離子的多反應監測離子掃描MRM的質荷比條件為： 25羥基維生素 D2的母離子的質荷比為413.35,對應的定量離子的質荷比為395.3,定性 離子的質荷比為83.1; 25羥基維生素 D3的母離子的質荷比為401.35,對應的定量離子的質荷比為383.3,定性 離子的質荷比為159.1; 所述液相色譜采用梯度洗脫模式，液相色譜條件為： 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18Column(2.1x50mm, 1·7μπι); 色譜柱柱溫:45°C; 進樣量:20ul; 流速:〇 .4ml/min; 流動相:流動相A為含2mM乙酸銨和0.1 %甲酸的水，流動相B為含2mM乙酸銨和0.1 %甲 酸的甲醇； 6d-25羥基維生素 D3和25羥基維生素 D3的保留時間為3.09min，6d-25羥基維生素02和25 羥基維生素 D2的保留時間為3.16min; (3) 以25羥基維生素02和25羥基維生素 D3的保留時間為定性依據，判斷25羥基維生素 D2 和25羥基維生素 D3的存在； 依據25羥基維生素 D#P25羥基維生素 D3與對應內標物在內標標準曲線上的峰面積比 值，計算血清樣品中的25羥基維生素出和25羥基維生素 D3的含量。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述反應監測離子掃描MRM的錐孔電壓、駐留 時間、碰撞能量條件如下：4. 根據權利要求2所述的方法，所述梯度洗脫的條件如下：5. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述質譜中質譜離子源參數如下： 電離源：電噴霧電離ESI源； 脫溶劑氣溫度:400°C; 脫溶劑氣流速:900L/Hr; 離子源溫度：120°C; 毛細管電壓：2500V。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述離心的條件為:在室溫下，以 13000r/min 的速度離心 5-lOmin。7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述用氮氣吹干沉淀是通入45-55 °〇的氮氣直至沉淀干燥。
【專利摘要】本發明提供了一種高靈敏高通量超高效液相色譜串聯質譜儀檢測25羥基維生素D的方法。向血清樣品中加入25羥基維生素D的內標物，加入硫酸鋅溶液和甲醇溶液進行蛋白沉淀；充分混勻后加入正己烷溶劑萃取；再充分混勻后離心，接著移取上清液并進行氮氣吹干，加入復溶液，得到待測樣品；對待測樣品用超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測；以25羥基維生素D2和/或25羥基維生素D3的定量離子對及定性離子對的保留時間為定性依據，采用內標標準曲線法定量。本發明前處理簡單，特異性、抗基質干擾能力強；檢測時間短，通量高，檢測精密度、靈敏度高，成本低廉。
【IPC分類】G01N30/88, G01N30/06
【公開號】CN105527364
【申請號】CN201510530370
【發明人】袁洪, 郭成賢, 江濤, 劉湘軍
【申請人】袁洪
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年8月26日