相萃取儀等貴重儀器，靈敏度和精密度更高，滿足臨 床檢測要求。另外，相比常規的液相色譜柱，超高效色譜柱的填料顆粒更細，同時耐壓能力 更強，檢測靈敏度更高，可W快速檢測，縮短分析時間，因此本發明在采用LC-MS/MS方法的 前提下，優化前處理過程和儀器設置參數，同時優化了LC-MS/MS方法中的流動相和梯度條 件，進而改善了色譜峰的峰形和響應值，使得25徑基維生素 D的檢測靈敏度顯著提高，適合 臨床推廣。
【附圖說明】
[0047]圖1是25徑基維生素化和化徑基維生素化的定量限（S/N= 10)。
【具體實施方式】 [004引實施例1
[0049] 所述超高效液相色譜串聯質譜儀檢測25徑基維生素 D的方法實包括如下步驟：
[0050] (1)前處理：
[0051 ]向人體血清樣品中加入25徑基維生素 D的內標物，加入硫酸鋒溶液和甲醇溶液進 行蛋白質沉淀;充分混勻后加入正己燒溶劑萃取;再充分混勻后離屯、，接著移取上清液并進 行氮氣吹干，加入復溶液，得到待測樣品；
[0052] 其中，所述人血清樣品與所述硫酸鋒溶液、甲醇溶液、正己燒萃取溶液的體積比為 1:1:2: 5;所述上清液與對應的原溶液的體積比為1:1;所述復溶液與人血清樣品的體積比 為 1:2。
[0053] 25徑基維生素 D內標物可W包括(16-25徑基維生素化和/或(16-25徑基維生素化。即 可W只包括少-25徑基維生素化，也可W只包括少-25徑基維生素化，也可W同時包括少-25徑 基維生素化和少-25徑基維生素化。
[0054] 如果只檢測25徑基維生素化（250皿2)，則可W只添加(16-25徑基維生素化；如果只 檢測25徑基維生素化(250HD3)，則可W只添加少-25徑基維生素化；
[00巧]如果同時檢測25徑基維生素化和25徑基維生素化，則可W同時添加(16-25徑基維生 素〇2和少-25徑基維生素 D3。
[0056] 對加入正己燒后的溶液的離屯、條件為：13000r/min的速度離屯、5min。
[0057] 對移取的上清液干燥的條件為:通50°C的氮氣直至干燥。
[0058] 所述復溶液為甲醇和水的混合物，其中，甲醇和水的體積比為70:30。
[0059] (2)檢測；
[0060] 對所述待測樣品采用超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測；
[0061] 所述檢測采用正離子模式，掃描方式采用多反應監測離子MRM;
[0062] MRM:Multiple Reaction Monitor,指多反應監測離子掃描；
[0063] 其中，內標定量離子對包括少-25徑基維生素化定量離子對和/或少-25徑基維生素 化定量離子對；
[0064] 具體的，當檢測少-25徑基維生素化時，采用少-25徑基維生素化的定量離子對；
[0065] 當檢測少-25徑基維生素化時，采用少-25徑基維生素化的定量離子對；
[0066] 當同時檢測(16-25徑基維生素化和(16-25徑基維生素〇3,采用(16-25徑基維生素化的 定量離子對和少-25徑基維生素化的定量離子對；
[0067] 目標定量離子對包括25徑基維生素化定量離子對和/或25徑基維生素化定量離子 對；目標定性離子對包括25?基維生素化定性離子對和/或化徑基維生素化定性離子對；
[0068] 具體而言，對25徑基維生素化進行檢測時，采用25徑基維生素化定量離子對和25徑 基維生素化定性離子對；
[0069] 對25徑基維生素化進行檢測時，采用25徑基維生素化定量離子對和25徑基維生素 化定性離子對；
[0070] 同時對25徑基維生素化和25徑基維生素化進行檢測時，分別采用25徑基維生素化 定量離子對和25徑基維生素化定性離子對及25徑基維生素化定量離子對和25徑基維生素化 定性離子對；
[0071] 內標定量離子對的多反應監測離子掃描MRM的條件包括：
[0072] 64-25?基維生素化定量離子對的母離子的質荷比為407.3,對應的子離子的質荷 比為159.1;
[0073] 64-25?基維生素化定量離子對的母離子的質荷比為419.3,對應的子離子的質荷 比為83.1;
[0074] 目標定量離子的多反應監測離子掃描MRM的條件包括：
[00巧]25徑基維生素化的母離子的質荷比為401.35，對應的定量離子的質荷比為383.3， 定性離子的質荷比為159.1;
[0076] 25徑基維生素化的母離子的質荷比為413.35,對應的定量離子的質荷比為395.3， 定性離子的質/荷比為83.1;
[0077] 其中，所述液相色譜采用梯度洗脫模式，液相色譜條件包括：
[007引 色譜柱:AC卵口Y UPLC 邸H C18 Column(2.1 X 50臟，1.7皿）；
[0079] 色譜柱柱溫:45°C;
[0080] 進樣量:20ul;
[0081 ]流速:0.4ml/min;
[0082] 梯度模式洗脫中流動相包括:A流動相為含2mM乙酸錠和0.1 %甲酸的水，B流動相 為含2mM乙酸錠和0.1 %甲酸的甲醇。
[0083] 采用上述流動相，在梯度洗脫中，25徑基維生素化的保留時間為3.16min，25^基 維生素化的保留時間為3.09min。
[0084] 多反應監測離子掃描MRM的條件如下： 物質 衛乎財 錐孔電比(V) 駐留時間樹 碰鐘能量巧） 250HD: 巧 3* ：24 0.05 1 円 250! ID， 413.35>83.! % 0.05 22
[00扣] - 250H 化 4(兒3 護 3S3.3* 24 ().()5 10 250HD：, 401.3扣|巧.1 24 0.05 28 ci6-250IlD2 419.35>83.1 24 0.05 22
[0086] d6-250HD3 407.35> 159.1 24 化 05 斂
[0087] 其中，*代表定量離子對
[0088] 可W理解，上述MRM的條件并不是只對應一種情形，可W是檢測25徑基維生素化， 也可W是檢測25徑基維生素化，還可W是同時檢測化徑基維生素化和25徑基維生素化。
[0089] 梯度洗脫條件如下： 時間Cm虹) A相比例（％) B相比例（％) 0.00 27 73 「 1 2.00 27 巧
[0090] 3.50 2 98 3.51 Tl 73 6.00 27 73
[0091] 質譜離子源參數包括：
[0092] 電離源:電噴霧電離ESI源；
[0093] 脫溶劑氣溫度:400°C;
[0094] 脫溶劑氣流速:900L/化；
[009引離子源溫度：120°C;
[0096] 毛細管電壓:2500V。
[0097] (3)定性判斷和定量計算：
[0098] 依據25徑基維生素化和/或25徑基維生素化的保留時間為定性依據，判斷25徑基維 生素化和/或化徑基維生素化的存在；
[0099] 具體而言，當檢測25徑基維生素化時，依據25徑基維生素化的保留時間判斷25徑基 維生素化的存在；
[0100] 當檢測25徑基維生素化時，依據25徑基維生素化的保留時間判斷25徑基維生素化 的存在；
[0101] 當同時檢測25徑基維生素化和25徑基維生素化時，依據25徑基維生素化和25徑基 維生素化的保留時間判斷化徑基維生素化和25徑基維生素化的存在。
[0102] 用超高效液相色譜串聯質譜法對樣品進行定性判定，在相同試驗條件下，樣品中 被測目標物質色譜峰定量離子對和定性離子對保留時間與標準溶液中對應物質色譜峰定 量離子對和定性離子對的保留時間一致，則可W判斷樣品中存在對應的目標物質。
[0103] 依據25徑基維生素化和/或25徑基維生素化與對應內標物在內標曲線上的峰面積 比值，計算人體血清樣品中的25徑基維生素化和/或化徑基維生素化的含量。
[0104] 具體而言，當檢測25徑基維生素化，依據25徑基維生素化與對應內標物在內標標準 曲線上的峰面積比值，計算人體血清中的25徑基維生素化的含量。
[0105] 當檢測25徑基維生素化，依據25徑基維生素化與對應內標物在內標標準曲線上的 峰面積比值，計算人體血清中的25徑基維生素化的含量。
[0106] 當同時檢測25徑基維生素化和25徑基維生素化時，依據25徑基維生素化和25徑基 維生素化與對應內標物在內標標準曲線上的峰面積比值，計算人體血清中25徑基維生素化 和25徑基維生素化的含量。基維生素化和25徑基維生素